Galectin-7通過TGFβ-Smad3途徑促進T淋巴細胞增殖和向Th1細胞偏移.pdf

1、第一部分 Galectin-7與急性排斥反應及T細胞應答相關性的研究
　　目的:研究galectin-7在小鼠心臟移植物中的表達與定位,以及該蛋白在心臟移植受鼠腹部引流淋巴結(jié)中的表達情況,以探討galectin-7與急性排斥反應及T細胞應答的相關性。
　　方法:建立小鼠腹部心臟移植模型,小鼠異基因(BALB/c→C57BL/6)和同基因(BALB/c→BALB/c)移植心臟分為急排組和對照組。急排組和對照組移植心臟分別于術后

2、3、5、7天獲取。應用Westernblot法檢測小鼠心臟移植物galectin-7蛋白的表達情況。Galectin-7在心臟移植物中的定位通過免疫組織化學染色法檢測。無菌分離心臟移植受鼠腹部引流淋巴結(jié),研磨淋巴結(jié),收集研磨后的液體,并將其制備成單細胞懸液,應用流式細胞術檢測CD4+T細胞和CD8+T細胞中galectin-7蛋白的表達。
　　結(jié)果:我們通過Westernblot法發(fā)現(xiàn)移植術后3、5、7天急排組移植心臟galect

3、in-7的表達量逐漸增高,且相同時間點急排組移植心臟galectin-7蛋白表達明顯高于對照組(0·85±0·03vs.0·69±0·05,1·15±0·11vs.0·81±0·02,和2·02±0·12vs.0·81±0·05;P<0·05)。免疫組織化學染色顯示galectin-7主要定位于急排組移植心臟的浸潤淋巴細胞及血管內(nèi)皮細胞,且該蛋白主要表達于細胞核和細胞漿中。此外,急排組受鼠腹部引流淋巴結(jié)CD4+galectin-7+T細

4、胞和CD8+galectin-7+T細胞占淋巴細胞的比例明顯高于對照組(28·0±1·0％vs.1·2±0·2%;12·4±0·8%vs.0·4±0·1%,P<0·01)。
　　結(jié)論:Galectin-7與急性排斥反應和T細胞應答有相關性,并可能發(fā)揮促進急性排斥反應的作用。這項發(fā)現(xiàn)提示galectin-7可能為急性排斥反應提供新的檢測指標和治療靶點。
　　第二部分Galectin-7蛋白對T淋巴細胞增殖和Thl/Th2平衡的

5、影響
　　目的:在功能性抗CD3/CD28抗體不存在或存在的情況下,研究galectin-7蛋白對T淋巴細胞增殖和Thl/Th2平衡的影響,以探討galectin-7蛋白在T細胞應答過程中的作用。
　　方法:分離BALB/c小鼠淋巴結(jié)并通過碾磨濾過將其制備成單細胞懸液,CFSE標記目的細胞。為研究galectin-7蛋白在T淋巴細胞增殖過程中的作用,依據(jù)加入galectin-7蛋白劑量的不同分為:空白對照組,實驗組(不同濃度

6、galectin-7蛋白)。另外,為了解在功能性抗CD3/CD28抗體存在的情況下galectin-7蛋白在T淋巴細胞增殖過程中的作用,依據(jù)加入galectin-7蛋白劑量的不同分為:雙抗對照組(抗CD3/CD28抗體),G7+雙抗組(不同濃度galectin-7蛋白+抗CD3/CD28抗體)。在48孔板中培養(yǎng)T淋巴細胞,每孔的T淋巴細胞個數(shù)為5×105個,分別加入功能性抗小鼠CD3/CD28抗體、重組小鼠galectin-7蛋白。37

7、℃、5%CO2條件下避光培養(yǎng)5天。應用流式細胞術檢測和分析T淋巴細胞亞群的增殖。運用ELISA法檢測上清IFN-γ、IL-4的濃度。運用熒光定量PCR法檢測IFN-γ、IL-4mRNA的表達量。
　　結(jié)果:Galectin-7蛋白單獨作用不具有誘導T細胞增殖的作用。然而,galectin-7蛋白與功能性抗CD3和抗CD28抗體聯(lián)合作用誘導T淋巴細胞增殖的作用,與單獨使用抗CD3/CD28抗體的雙抗對照組相比顯著增強(P<0.01)

8、。隨著galectin-7濃度增加,T淋巴細胞增殖加強,呈劑量依賴性(P<0.05)。在此基礎上,我們進一步研究galectin-7對T淋巴細胞分化的影響。Galectin-7蛋白在抗CD3/CD28抗體存在條件下與T淋巴細胞共培養(yǎng)5天后的Th1細胞因子(IFN-γ)和Th2細胞因子(IL-4)表達和分泌,與單獨使用抗CD3/CD28抗體的雙抗對照組相比,galectin-7顯著增強T淋巴細胞表達和分泌INF-γ(P<0.05),對IL

9、-4的產(chǎn)生無明顯影響(P>0.05)。IFN-γ是Th1細胞占優(yōu)勢的重要標志,該結(jié)果提示,在抗CD3/CD28抗體存在條件下,galectin-7誘導Th1/Th2細胞的平衡向Th1細胞優(yōu)勢應答偏移。
　　結(jié)論:這些結(jié)果提示galectin-7具有新的功能:促進活化的T淋巴細胞增殖和向Th1細胞應答偏移。Galectin-7蛋白具有抗感染、抑制腫瘤細胞生長、誘導自身免疫性疾病和排斥反應的作用。通過抑制galectin-7蛋白的表達

10、有可能誘導移植免疫耐受和治療自身免疫性疾病。所以,galectin-7在感染、腫瘤、自身免疫性疾病及器官移植后排斥反應等免疫相關性疾病的認知和治療方面可能具有重要意義。
　　第三部分Galectin-7蛋白對TGFβ/Smad3通路的抑制作用
　　目的:在功能性抗CD3/CD28抗體存在的情況下,研究galectin-7蛋白對pSmad3在T淋巴細胞中分布的影響,探討galectin-7蛋白促進活化的T淋巴細胞增殖并誘導其向

11、Th1細胞優(yōu)勢應答偏移的作用是否與抑制TGFβ/Smad3通路有關。
　　方法:分離BALB/c小鼠淋巴結(jié)并通過碾磨濾過將其制備成單細胞懸液,在抗CD3/CD28抗體存在的情況,根據(jù)是否加入小鼠galectin-7蛋白分為兩組:雙抗對照組(抗CD3/CD28抗體),G7+雙抗組(galectin-7蛋白+抗CD3/CD28抗體)。功能性抗小鼠CD3/CD28抗體與T淋巴細胞共同孵育24h后,G7+雙抗組加入重組小鼠galectin

12、-7蛋白孵育60min。分別應用Westernblot和免疫熒光染色的方法分析兩組T淋巴細胞中galectin-7及pSmad3的表達和定位的情況。
　　結(jié)果:免疫熒光染色結(jié)果顯示,雙抗對照組T淋巴細胞galectin-7和pSmad3蛋白均勻分布于胞核和胞漿,而G7+雙抗組T淋巴細胞galectin-7和pSmad3蛋白主要分布于胞漿,聚集于胞核周圍。Westernblot結(jié)果顯示,galectin-7和pSmad3蛋白在G7+

13、雙抗組T淋巴細胞胞核的表達量顯著低于雙抗對照組(P<0.05)。與此同時,galectin-7和pSmad3蛋白在G7+雙抗組T淋巴細胞胞漿的表達量顯著高于雙抗對照組(P<0.05)。
　　結(jié)論:本研究表明,galectin-7可以與抗CD3/CD28抗體活化的T細胞中的pSmad3蛋白相互作用,并誘導pSmad3蛋白向胞漿轉(zhuǎn)位。這項發(fā)現(xiàn)意味著galectin-7有阻斷活化的T淋巴細胞TGFβ/Smad信號通路的作用。本研究首次闡