G-CSF誘導T淋巴細胞向TH2分化的機制研究.pdf

1、目的： G-CSF目前被廣泛地應用于外周血造血干細胞移植，盡管在采集物的細胞中CD3+的細胞數(shù)增加了十倍，但是嚴重的急性GVHD的發(fā)生率并沒有增加。G-CSF目前被稱為具有T細胞免疫耐受作用的免疫調(diào)節(jié)因子(Mediator of T Cell Tolerance)，目前對G-CSF誘導免疫耐受機制的研究主要有以下幾個方面：對T細胞影響，rhG-CSF動員使Th細胞向Th2發(fā)生極化，CD4+Th細胞激活后分化為功能不同的Th1和T

2、h2效應細胞。Th1細胞分泌[L-2、IFN-γ，TNF-β等，介導細胞免疫應答、在BMT中介導aGVHD的發(fā)生。Th2細胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-13等細胞因子，介導體液免疫應答，在BMT中和減少aGVHD的發(fā)生有關。此外對T細胞增殖、分化、凋亡均有影響。目前仍需闡明的問題G-CSF的作用是直接作用于T細胞還是通過其他細胞因子間接的作用?G-CSF作用下，影響T細胞向TH2分化的原因有哪些?G-C

3、SF誘導T細胞向TH2分化是受何種轉錄因子調(diào)控?以上問題的解決將為今天通過干預T細胞向TH2分化，降低aGVHD的發(fā)生奠定理論基礎。 方法： 本研究采取G-CSF體內(nèi)和體外刺激兩種方式：體外刺激方式時，抽取健康志愿者外周血，分離單個核細胞。CD4細胞免疫磁珠分離、CD4+T淋巴細胞，在體外應用不同濃度G-CSF刺激，觀測體外G-CSF對T淋巴細胞的直接作用。體內(nèi)研究選取臨床上進行骨髓或外用血造血干細胞移植的供者，在G-C

4、SF動員前后采取標本，純化CD4+T淋巴細胞，觀測G-CSF體內(nèi)刺激對T細胞的作用。主要的研究內(nèi)容包括MTT方法檢測G-CSF對T淋巴細胞增殖和抗原反應性的影響，混合淋巴細胞反應(MLR)檢測T細胞的抗原反應性。FCM方法檢測TH1/TH2比率。Real-time PCR檢測G-CSF刺激淋巴細胞分化相關基因表達的變化。包括G-CSF受體基因(G-CSFR)、CD4+淋巴細胞分泌細胞因子的基因(IL-4、IFN-γ)一些分化調(diào)控及轉錄因

5、子基因(CD28、CTLA-4、ICOS、GATA3、T-bet、FOXP3)。 結果： 經(jīng)過CD4免疫磁珠的分離，得到的CD4+T淋巴細胞純度在95％以上，經(jīng)過G-CSF的刺激，增殖指數(shù)呈時間依賴性增高。在G-CSF處理之前最低，在G-CS處理后的4-8個小時，增殖指數(shù)開始上升，在24-48小時，增殖指數(shù)達到高峰，超過72小時，增殖指數(shù)下降。從LTT的數(shù)值和抑制率的分析K，可以表明G-CSF的刺激可以抑制T細胞對PHA

6、的反應能力，對于應用G-CSF刺激后的CD4+T淋巴細胞，細胞的LTT值呈下降趨勢，抑制率呈上升趨勢。G-CSF住體內(nèi)和體外刺激同樣抑制T淋巴細胞的抗原反應能力，兩組沒有顯著性差異。通過對體內(nèi)、體外兩組刺激方式下的CD4+T淋巴細胞的TH1/TH2分析，結果顯示經(jīng)過G-CSF動員，CD4+T淋巴細胞中分泌IFN-γ的TH1細胞減少，而分泌IL-4的TH2細胞增加，動員后的TH1/TH2比值顯著降低。在體內(nèi)的刺激還是在體外培養(yǎng)的細胞進行G

7、-CSF刺激，對T細胞亞群分化的調(diào)節(jié)是沒有差異的。在體外培養(yǎng)的G-CSF刺激下，平均表達水平升高達到統(tǒng)計學顯著性差異的基因有IL-4、CTLA-4、GATA3；平均表達水平降低具有統(tǒng)計學意義的基因是IFN-γ和T-bet。TFN-γ和T-bet基因分別存在顯著相關性；IL-4和GATA-3基因也存在相關性。 結論： 體外G-CSF的刺激可以直接作用于CD4+淋巴細胞，并使之增殖，但是對抗原反應性降低。體外G-CSF的刺激