Batf3依賴的樹(shù)突狀細(xì)胞通過(guò)誘導(dǎo)Th1促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化.pdf

1、目的:
　　動(dòng)脈粥樣硬化是一種免疫相關(guān)的慢性炎癥性疾病，天然免疫和適應(yīng)性免疫在動(dòng)脈粥樣硬化中均發(fā)揮至關(guān)重要的作用。不同T細(xì)胞亞群在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，樹(shù)突狀細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中參與調(diào)控T細(xì)胞反應(yīng)。Baft3是調(diào)控樹(shù)突狀細(xì)胞亞群分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子。本課題研究Baft3依賴的樹(shù)突狀細(xì)胞亞群對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化疾病的影響。并深入探討其對(duì)天然免疫和適應(yīng)性免疫的調(diào)控作用，為將來(lái)動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防及治療提供理論依據(jù)。

2、>　　方法:
　　1、通過(guò)小鼠雜交技術(shù)建立Batf3-/-小鼠與Apoe-/-小鼠雙基因缺陷小鼠。主要方法為Batf3-/-小鼠與Apoe-/-小鼠雜交產(chǎn)生F1代，繼續(xù)將F1代合籠雜交產(chǎn)生F2代，經(jīng)幾輪雜交后，通過(guò)對(duì)Batf3基因和Apoe基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳來(lái)鑒定小鼠基因型。進(jìn)一步通過(guò)流式細(xì)胞儀分析小鼠脾臟和主動(dòng)脈DC亞群的變化。
　　2、以Apoe-/-小鼠為對(duì)照，通過(guò)高脂飲食誘導(dǎo)Batf3-/-A

3、poe-/-雙基因缺陷小鼠動(dòng)脈粥樣硬化疾病模型。
　　3、Batf3-/-Apoe-/-雙基因缺陷小鼠高脂飲食9周，進(jìn)行心臟灌注，包埋心臟，進(jìn)行冷凍切片。
　　4、對(duì)切片進(jìn)行油紅O染色檢測(cè)主動(dòng)脈根部斑塊的形成，并通過(guò)軟件計(jì)算主動(dòng)脈根部斑塊面積大小及官腔比。并采用HE染色觀察主動(dòng)脈斑塊中炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。
　　5、檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組體重的變化及用生化分析儀檢測(cè)血漿中總膽固醇和甘油三脂濃度。
　　6、取脾臟、主動(dòng)脈用酶

4、消化并制備單細(xì)胞懸液。采用多色熒光標(biāo)記及流式細(xì)胞儀檢測(cè)，并用Flowjo軟件進(jìn)行分析脾臟的DC亞群的變化及功能分子的表達(dá)，以及中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞的比例，及活化增殖的影響。
　　7、采用刺激液刺激并進(jìn)行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，檢測(cè)Th1和Th17細(xì)胞的變化
　　8、胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化。
　　9、以C57小鼠為對(duì)照，Apoe-/-高脂飲食9周后，分選小鼠脾臟CD8+DC和CD8-

5、DC亞群，通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)IL-12P35基因表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、通過(guò)小鼠雜交及PCR鑒定篩選出Batf3基因和Apoe基因雙缺陷的小鼠，命名為Batf3-/-Apoe-/-小鼠。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)Batf3-/-Apoe-/-雙缺陷小鼠發(fā)現(xiàn)脾臟CD8a+DC亞群顯著減少(P＜0.001)和主動(dòng)脈CD103+DC亞群缺失
　　2、高脂飲食9周后油紅O染色表明，與對(duì)照組Apoe-/-小鼠相比，B

6、atf3-/-Apoe-/-雙基因缺陷小鼠主動(dòng)脈根部斑塊面積顯著減小，HE染色結(jié)果表明斑塊內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少。
　　3、通過(guò)生化分析儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組Apoe-/-小鼠相比，Batf3-/-Apoe-/-雙基因缺陷小鼠血漿總膽固醇和甘油三脂均無(wú)顯著差異。體重檢測(cè)兩組間也無(wú)顯著差異。
　　4、通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Batf3-/-Apoe-/-雙基因缺陷小鼠脾臟CD8a+ DC亞群顯著減少(P＜0.001)且主動(dòng)脈CD

7、103+DC亞群缺失。脾臟cDC比例顯著升高，而其IA/IE的表達(dá)顯著降低。
　　5、通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組Apoe-/-小鼠相比，Batf3-/-Apoe-/-雙基因缺陷小鼠脾臟中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞比例均無(wú)顯著差異，而CD4+T細(xì)胞比例顯著增加。
　　6、對(duì)脾臟B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞活化、增殖的流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明，兩組之間B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞活化、增殖均無(wú)顯

8、著差異。Batf3缺陷不影響CD4+T細(xì)胞的活化而其增殖顯著增加。
　　7、通過(guò)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色及流式細(xì)胞分析表明，與對(duì)照組Apoe-/-小鼠相比Batf3-/-Apoe-/-雙基因缺陷小鼠Th17和Treg細(xì)胞均無(wú)顯著差異，而Th1細(xì)胞比例顯著減少(P＜0.001)。
　　8、通過(guò)Real-time PCR檢測(cè)IL-12P35基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與C57小鼠相比，Apoe-/-小鼠CD8+DC表達(dá)的IL-12P35顯著增加，而

9、CD8-DC表達(dá)的IL-12P35無(wú)明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1、在動(dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)生過(guò)程中，Batf3缺陷引起主動(dòng)脈根部斑塊面積顯著減小，斑塊內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少而不影響血漿中總膽固醇和甘油三酯的濃度。
　　2、Batf3缺陷引起脾臟CD8a+DC亞群顯著減少（P＜0.001）且主動(dòng)脈CD103+DC亞群缺失，Batf3依賴的DC亞群可能是通過(guò)高表達(dá)IL-12P35誘導(dǎo)Th1分化進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。