Batf3依賴的樹突狀細(xì)胞通過誘導(dǎo)Th1促進動脈粥樣硬化.pdf

1、目的:
　　動脈粥樣硬化是一種免疫相關(guān)的慢性炎癥性疾病，天然免疫和適應(yīng)性免疫在動脈粥樣硬化中均發(fā)揮至關(guān)重要的作用。不同T細(xì)胞亞群在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，樹突狀細(xì)胞在動脈粥樣硬化過程中參與調(diào)控T細(xì)胞反應(yīng)。Baft3是調(diào)控樹突狀細(xì)胞亞群分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子。本課題研究Baft3依賴的樹突狀細(xì)胞亞群對動脈粥樣硬化疾病的影響。并深入探討其對天然免疫和適應(yīng)性免疫的調(diào)控作用，為將來動脈粥樣硬化的預(yù)防及治療提供理論依據(jù)。

2、>　　方法:
　　1、通過小鼠雜交技術(shù)建立Batf3-/-小鼠與Apoe-/-小鼠雙基因缺陷小鼠。主要方法為Batf3-/-小鼠與Apoe-/-小鼠雜交產(chǎn)生F1代，繼續(xù)將F1代合籠雜交產(chǎn)生F2代，經(jīng)幾輪雜交后，通過對Batf3基因和Apoe基因進行PCR擴增，然后通過瓊脂糖凝膠電泳來鑒定小鼠基因型。進一步通過流式細(xì)胞儀分析小鼠脾臟和主動脈DC亞群的變化。
　　2、以Apoe-/-小鼠為對照，通過高脂飲食誘導(dǎo)Batf3-/-A

3、poe-/-雙基因缺陷小鼠動脈粥樣硬化疾病模型。
　　3、Batf3-/-Apoe-/-雙基因缺陷小鼠高脂飲食9周，進行心臟灌注，包埋心臟，進行冷凍切片。
　　4、對切片進行油紅O染色檢測主動脈根部斑塊的形成，并通過軟件計算主動脈根部斑塊面積大小及官腔比。并采用HE染色觀察主動脈斑塊中炎癥細(xì)胞的浸潤。
　　5、檢測實驗組和對照組體重的變化及用生化分析儀檢測血漿中總膽固醇和甘油三脂濃度。
　　6、取脾臟、主動脈用酶

4、消化并制備單細(xì)胞懸液。采用多色熒光標(biāo)記及流式細(xì)胞儀檢測，并用Flowjo軟件進行分析脾臟的DC亞群的變化及功能分子的表達，以及中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞的比例，及活化增殖的影響。
　　7、采用刺激液刺激并進行胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，檢測Th1和Th17細(xì)胞的變化
　　8、胞內(nèi)細(xì)胞因子染色，檢測調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化。
　　9、以C57小鼠為對照，Apoe-/-高脂飲食9周后，分選小鼠脾臟CD8+DC和CD8-

5、DC亞群，通過Real-time PCR檢測IL-12P35基因表達。
　　結(jié)果:
　　1、通過小鼠雜交及PCR鑒定篩選出Batf3基因和Apoe基因雙缺陷的小鼠，命名為Batf3-/-Apoe-/-小鼠。通過流式細(xì)胞儀檢測Batf3-/-Apoe-/-雙缺陷小鼠發(fā)現(xiàn)脾臟CD8a+DC亞群顯著減少(P＜0.001)和主動脈CD103+DC亞群缺失
　　2、高脂飲食9周后油紅O染色表明，與對照組Apoe-/-小鼠相比，B

6、atf3-/-Apoe-/-雙基因缺陷小鼠主動脈根部斑塊面積顯著減小，HE染色結(jié)果表明斑塊內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。
　　3、通過生化分析儀檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組Apoe-/-小鼠相比，Batf3-/-Apoe-/-雙基因缺陷小鼠血漿總膽固醇和甘油三脂均無顯著差異。體重檢測兩組間也無顯著差異。
　　4、通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，Batf3-/-Apoe-/-雙基因缺陷小鼠脾臟CD8a+ DC亞群顯著減少(P＜0.001)且主動脈CD

7、103+DC亞群缺失。脾臟cDC比例顯著升高，而其IA/IE的表達顯著降低。
　　5、通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組Apoe-/-小鼠相比，Batf3-/-Apoe-/-雙基因缺陷小鼠脾臟中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞比例均無顯著差異，而CD4+T細(xì)胞比例顯著增加。
　　6、對脾臟B細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞活化、增殖的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果表明，兩組之間B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞活化、增殖均無顯

8、著差異。Batf3缺陷不影響CD4+T細(xì)胞的活化而其增殖顯著增加。
　　7、通過胞內(nèi)細(xì)胞因子染色及流式細(xì)胞分析表明，與對照組Apoe-/-小鼠相比Batf3-/-Apoe-/-雙基因缺陷小鼠Th17和Treg細(xì)胞均無顯著差異，而Th1細(xì)胞比例顯著減少(P＜0.001)。
　　8、通過Real-time PCR檢測IL-12P35基因的表達發(fā)現(xiàn)，與C57小鼠相比，Apoe-/-小鼠CD8+DC表達的IL-12P35顯著增加，而

9、CD8-DC表達的IL-12P35無明顯差異。
　　結(jié)論:
　　1、在動脈粥樣硬化疾病發(fā)生過程中，Batf3缺陷引起主動脈根部斑塊面積顯著減小，斑塊內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤明顯減少而不影響血漿中總膽固醇和甘油三酯的濃度。
　　2、Batf3缺陷引起脾臟CD8a+DC亞群顯著減少（P＜0.001）且主動脈CD103+DC亞群缺失，Batf3依賴的DC亞群可能是通過高表達IL-12P35誘導(dǎo)Th1分化進而促進動脈粥樣硬化斑塊的形成。