樹突狀細(xì)胞在兔動脈粥樣硬化模型中作用的研究.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)研究從選擇合適動脈硬化動物模型出發(fā)，以期在合適的動脈斑塊中檢測炎癥及樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）成熟狀況，并檢測AS動物模型中可能存在的危險(xiǎn)因素與DCs成熟的關(guān)系，探討DCs在易損斑塊形成過程中的作用，為冠心病免疫發(fā)病機(jī)制的闡明奠定一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 本課題分為三個(gè)部分，首先以兔腹主動脈粥樣硬化模型為研究對象，應(yīng)用病理切片、血管造影及體外超聲檢測斑塊成膜情況，分析其斑塊性質(zhì)，建立研究模型基礎(chǔ)；從建立的A

2、S實(shí)驗(yàn)動物出發(fā)，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)和免疫組織化學(xué)觀察DCs在血液、血管組織、脾臟和肝臟及淋巴結(jié)的分布情況，重點(diǎn)觀察DCs的分布情況對AS發(fā)生發(fā)展的影響；體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)動物骨髓源DCs，并通過ELISA、流式細(xì)胞技術(shù)及免疫檢測技術(shù)觀察模型動物的自體血清與ox-LDL刺激對DCs成熟誘導(dǎo)情況，以明確AS動物模型中DCs與典型斑塊形成的可能機(jī)制。 結(jié)果分述如下: 1．新西蘭兔的模型制備及相關(guān)檢測。 1．1 動脈粥樣硬化新西

3、蘭兔成模情況及各組兔一般情況的比較： 16只雄性純種新西蘭白兔，體重2．50±0．14kg，隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，各組予以腹主動脈內(nèi)膜的球囊損傷后，實(shí)驗(yàn)組以高脂飲食喂養(yǎng)2月，對照組則以正常飲食喂養(yǎng)2月。給予高膽固醇飲食喂養(yǎng)2月，喂養(yǎng)后兔的體重較喂養(yǎng)前在實(shí)驗(yàn)組與對照組均數(shù)均明顯增加，差異有顯著性意義（P=0．000）；實(shí)驗(yàn)組喂養(yǎng)后較喂養(yǎng)前的TC、TG、LDL均數(shù)增高，差異有顯著性意義（P=0．000）；實(shí)驗(yàn)組喂養(yǎng)后與對照組喂養(yǎng)后

4、比較，其TC、TG、LDL均數(shù)明顯增高，差異有顯著性意義（P=0．000）。 1．2 各組新西蘭白兔腹主動脈造影及外周血管超聲情況的比較： 兩組新西蘭白兔喂養(yǎng)2月后，行腹主動脈造影檢查及外周血管超聲檢查，分別比較喂養(yǎng)2月后兩組新西蘭白兔腹主動脈硬化斑塊形成對動脈管腔變化的影響，并觀察麥角新堿對球囊剝脫部位誘發(fā)痙攣情況的比較。 在腹主動脈造影下，測量藥物刺激后血管收縮率，t檢驗(yàn)顯示實(shí)驗(yàn)組的損傷部位和未損傷部位之間以

5、及實(shí)驗(yàn)組的損傷部位與對照組的損傷部位之間血管收縮率差異存在顯著性意義（P=0．000）。 以體表超聲評價(jià)血管偏心指數(shù)（斑塊偏心指數(shù)=斑塊最厚處斑塊厚度/該部位對側(cè)斑塊最薄處斑塊厚度）。結(jié)果顯示偏心指數(shù)較大的斑塊在藥物刺激后血管收縮明顯增加，偏心指數(shù)與血管收縮率之間呈顯著正相關(guān)（r=0．983，P=0．000）。 1．3 各組新西蘭白兔腹主動脈內(nèi)膜增生情況比較： 兩組新西蘭白兔喂養(yǎng)2月后，分別留取球囊剝脫部位及臨近

6、剝脫部位的腹主動脈血管標(biāo)本。比較喂養(yǎng)2月兩組新西蘭白兔主動脈形態(tài)學(xué)，實(shí)驗(yàn)組光鏡下見中膜和內(nèi)膜均明顯增厚，有較多增生的血管平滑肌細(xì)胞，呈環(huán)形排列整齊，新生內(nèi)膜中有大量細(xì)胞外基質(zhì)形成，管腔明顯狹窄。各種參數(shù)如內(nèi)彈力膜環(huán)繞總面積、新生內(nèi)膜面積、管腔面積及內(nèi)膜增生百分比的結(jié)果比較，四組之間明顯差異，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組球囊剝脫部位與臨近剝脫部位和對照組相比，新生內(nèi)膜面積顯著增大，差異有顯著性意義（P=0．004），管腔面積顯著減小，差異有顯

7、著性意義（P=0．000），內(nèi)膜增生百分比明顯增大，差異有顯著性意義（P=0．001）。說明實(shí)驗(yàn)組新西蘭白兔球囊剝脫部位的主動脈內(nèi)膜有新生內(nèi)膜形成。 1．4 各組新西蘭白兔血清NO水平及血管標(biāo)本內(nèi)eNOS酶蛋白表達(dá)的比較： 采用硝酸還原酶法對兩組新西蘭白兔喂養(yǎng)2月后的血清NO水平進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，血清NO水平下降的差異有顯著性意義（P=0．002）。 采用免疫組化對各組血管組織中eNOS酶蛋白

8、含量和定位進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示對照組血管組織中，內(nèi)皮細(xì)胞有陽性著色，球囊剝脫部位與臨近剝脫部位內(nèi)皮細(xì)胞陽性著色點(diǎn)無明顯差異；實(shí)驗(yàn)組與對照組相比球囊剝脫部位內(nèi)膜的陽性著色減少，內(nèi)皮下層出現(xiàn)散在的陽性著色點(diǎn)，而臨近球囊剝脫部位內(nèi)膜陽性著色點(diǎn)較對照組無明顯差異。說明高脂血癥可以導(dǎo)致血漿NO水平下降，但對血管內(nèi)皮eNOS酶表達(dá)無明顯影響，只有在血管內(nèi)皮損傷后，血漿膽固醇進(jìn)入內(nèi)膜進(jìn)一步演變成有害膽固醇蛋白，進(jìn)而對內(nèi)皮功能產(chǎn)生影響。 2．兔動

9、脈粥樣硬化與炎癥及細(xì)胞免疫的關(guān)系。 通過ELISA方法檢測實(shí)驗(yàn)組血漿炎癥因子表達(dá)水平，并流式細(xì)胞檢測技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法，分析AS動物模型血管壁內(nèi)DCs及免疫細(xì)胞的分布，觀察是否存在與正常對照組之間的區(qū)別。 2．1 血生化指標(biāo)及炎癥指標(biāo)的檢測： 制備模型2月后，通過ELISA方法檢測實(shí)驗(yàn)動物血漿炎癥因子表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)組兔血清sICAM、sVCAM、IL-6、TNF、hsCRP的含量與對照組相比，存在顯著性差異（

10、P<0．01）。提示在兔動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中存在炎癥反應(yīng)，黏附分子與CRP等炎癥因子共同促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)展。 2．2 兔DCs表型分子S100及抗原呈遞細(xì)胞活性分子CD86、MHCⅡ分別在兩組剝脫及未剝脫血管部位的表達(dá)情況： 制備模型2月后，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，實(shí)驗(yàn)組血管剝脫部位的CD86、MHCⅡ、S100含量分別與未剝脫部位、對照組剝脫部位的血管相比明顯升高，差異有顯著意義（P<0．01）；CD86、MH

11、CⅡ、S100的含量在實(shí)驗(yàn)組未剝脫部位、對照組剝脫部位及未剝脫部位的血管兩兩之間，差異無顯著性意義（P>0．05）。在模型兔剝脫部位血管壁組織內(nèi)檢測到兔特異性的DCs標(biāo)記分子明顯增多，說明實(shí)驗(yàn)組較對照兔腹主動脈血管壁內(nèi)DCs明顯升高；而檢測抗原呈遞細(xì)胞活性分子CD86及MHcn含量也較對照組明顯升高，說明抗原呈遞細(xì)胞活化與AS的進(jìn)展高度相關(guān) 3．兔外周血來源的DCs可以在模型自體血清及AS相關(guān)物質(zhì)刺激下誘導(dǎo)成熟，并具有誘導(dǎo)T細(xì)胞

12、增殖的能力。 制模前兔外周血來源的DCs分為4組，空白組予以PBS干預(yù)，對照組予以制模前的兔自體血清干預(yù)（10%），實(shí)驗(yàn)組予以制模后兔自體血清干預(yù)（10%），ox-LDL組予以ox-LDL（10 μg/mL）干預(yù)。 3．1 兔外周血源的DCs培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)鑒定： 兔外周血源的DCs在光學(xué)顯微鏡下可見懸浮生長，部分細(xì)胞聚集成簇，細(xì)胞表面有數(shù)量不等、形態(tài)不一的樹突樣突起；在掃描電鏡下細(xì)胞呈不規(guī)則形，表面粗糙，胞體有形態(tài)

13、不一的突起。 3．2 各組兔外周血源的DCs的表型流式細(xì)胞學(xué)檢測： 空白組、實(shí)驗(yàn)組、對照組以及ox-LDL組的兔外周血源的細(xì)胞培養(yǎng)前后的表型流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果經(jīng)One-Way ANOVA檢驗(yàn)顯示：MHCⅡ（P=0．000）、CD86（P=0．001）、CD14 （P=0．000）在各自的不同組間的差異有顯著性意義，對照組、實(shí)驗(yàn)組與ox-LDL組的MHCⅡ、CD86的表達(dá)較空白組上調(diào)，差異有顯著性意義（P<0．05），實(shí)驗(yàn)

14、組與ox-LDL組的CD14表達(dá)下調(diào)明顯，差異有顯著性意義（P<0．01）。對照組表現(xiàn)為CD86+/MHCⅡ+/CD14dim，區(qū)別于空白組單核／巨噬細(xì)胞的MHCⅡ+/CD14+的表型特征。在實(shí)驗(yàn)組自體血清環(huán)境以及ox-LDL組的ox-LDL刺激后，MHC Ⅱ和CD86表達(dá)繼續(xù)上調(diào)，CD14+/dim則轉(zhuǎn)化為CD14-，其MHC Ⅱ+/CD86+/CD14-的表達(dá)為成熟樹突狀細(xì)胞的表現(xiàn)。 3．3 混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)： 各組

15、的兔細(xì)胞按照不同比例（1：10、1：50、1：100）與同種異源的T淋巴細(xì)胞混合，加DMSO后用酶標(biāo)儀檢測波長490nm的A值。結(jié)果顯示各組均可產(chǎn)生不同程度的增殖反應(yīng)，析因分析表明混合比例因素（P=0．000）和分組因素（P=0．000）對MLR的結(jié)果影響均有顯著性意義，且1：10的比例時(shí)增殖反應(yīng)最強(qiáng)。One-Way ANOVA檢驗(yàn)各組在不同混合比例下的差異，實(shí)驗(yàn)組（P=0．026）各比例間差異有顯著性意義。One-Way ANOVA檢

16、驗(yàn)不同比例的MLR在各組之間的差異，結(jié)果提示在1：10及1：50混合比例時(shí)各組之間比較有顯著性意義（P=0．002），且ox-LDL組和實(shí)驗(yàn)組較空白組具有更強(qiáng)的刺激異體淋巴細(xì)胞增殖的能力，比較有顯著性意義（P<0．05），說明經(jīng)高脂血清環(huán)境培養(yǎng)的DCs與ox-LDL刺激生成的DCs具有更強(qiáng)的抗原提呈能力，并且隨著DCs數(shù)量的增多，刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力增強(qiáng)。 通過上述三個(gè)部分的實(shí)驗(yàn)，得出以下結(jié)論： 1.通過球囊內(nèi)

17、皮剝脫并高脂飲食2月后，可形成明確的兔腹主動脈硬化斑塊，該斑塊具有顯著的內(nèi)膜增生、管腔狹窄等特點(diǎn)； 2.模型兔腹主動脈斑塊具有部分類似人動脈硬化的特點(diǎn)，體表超聲顯示該斑塊呈密度低、偏心形等特點(diǎn)，麥角新堿誘發(fā)下腹主動脈造影顯示球囊內(nèi)皮剝脫部位可誘發(fā)明顯的血管痙攣； 3.斑塊形成部位eNOS減少說明斑塊部位內(nèi)皮功能嚴(yán)重受損； 4.模型兔血漿炎癥因子分泌增多，說明炎癥與AS形成高度相關(guān)； 5.模型兔血管壁DCs