HPV16 E7通過Smad7促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制.pdf

1、研究背景及目的: 人類乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)不但是宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的重要因素，還與外陰和肛周鱗癌的形成密切相關(guān)。在大約70～100％的肛周鱗癌中可以檢出高危型HPV-DNA。其中，HPV16是最為常見的高危型HPV。HPV16 E7可參與大多數(shù)宮頸癌和某些特定部位上皮腫瘤尤其是頭頸部和生殖器等部位鱗癌的成瘤過程。大量臨床病理研究證實(shí)：在口腔癌、乳腺癌、胃癌等人類多種惡性上皮腫瘤中，HPV

2、16 E7的表達(dá)與腫瘤分化低、易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及預(yù)后差密切相關(guān)。 TGFp是一類對上皮細(xì)胞生長有潛在抑制作用的細(xì)胞因子。TGFp信號從膜受體到胞核的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)由多種Smad蛋白介導(dǎo)和調(diào)節(jié)。Smad7是TGFp信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最為重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，Smad7表達(dá)升高可對TGFp信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起到限制作用。已有研究發(fā)現(xiàn)，TGFp在部分HPV16感染的惡性腫瘤組織中表達(dá)升高，然而卻并未發(fā)揮抑制腫瘤增殖的作用；Smad7在包括表皮鱗癌

3、在內(nèi)的多種上皮源性惡性腫瘤中也呈表達(dá)上調(diào)。近期研究還發(fā)現(xiàn)，Smad7高表達(dá)是胃癌患者出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個(gè)獨(dú)立的相關(guān)因素。Smad7在癌形成和轉(zhuǎn)移過程中的作用可能與其具有阻斷TGFp信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和上調(diào)增殖相關(guān)調(diào)節(jié)因子的表達(dá)有關(guān)。 針對TGFp在部分HPV16感染的惡性腫瘤組織中表達(dá)升高，卻不能發(fā)揮抑制腫瘤增殖作用的現(xiàn)象，以及HPV16與外陰和肛周鱗癌形成的密切關(guān)系和Smad7在癌形成和轉(zhuǎn)移過程中的重要作用，我們設(shè)想，在已有癌形成的

4、基礎(chǔ)上HPV16 E7是否還可影響腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲呢？HPV16 E7是否有可能通過影響Smad7的表達(dá)而增加皮膚鱗狀細(xì)胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移呢？為此，我們以HPV16與TGFp信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中重要的抑制性因子Smad7的關(guān)系作為研究切入點(diǎn)，檢測皮膚鱗癌組織中HPV16 E7和Smad7的表達(dá)，并分析其表達(dá)與皮膚鱗癌臨床病理特征的關(guān)系；構(gòu)建HPV16 E7表達(dá)載體，研究外源性HPV16 E7對人表皮鱗癌A431細(xì)胞的作用，探討HPV16 E

5、7作為一種獨(dú)立因素對A431細(xì)胞中Smad7等分子表達(dá)的影響以及對A431細(xì)胞生長、增殖和侵襲的影響；并觀察A431細(xì)胞在Smad7沉默后增殖和侵襲等生物學(xué)行為的變化。深入研究HPV16 E7和Smad7在皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用，對于全面理解皮膚鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移機(jī)制具有重要意義。 研究方法與結(jié)果: 1.應(yīng)用PCR和免疫組織化學(xué)技術(shù)分別檢測HPV16 E7基因和Smad7蛋白在37例皮膚鱗狀細(xì)胞癌

6、組織和30例正常皮膚中的表達(dá)情況。37例皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的HPV16E7陽性檢出率為16.2％(6/37)，與正常皮膚比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)； Smad7的陽性表達(dá)率為86.5％(32/37)。HPV16 E7表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.01)和組織分化程度顯著相關(guān)(P<0.05)。Smad7的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化程度也有相關(guān)性(P<0.05)，并且皮膚鱗狀細(xì)胞癌中HPV16 E7的感染與Smad7的陽性表達(dá)之間具有相關(guān)性

7、(P<0.05)。 2.應(yīng)用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了HPV16 E7真核表達(dá)載體，并以A431表皮鱗癌細(xì)胞為靶細(xì)胞，通過基因轉(zhuǎn)染的方法使A431細(xì)胞高表達(dá)HPV16 E7。通過qRT-PCR和Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染后的A431細(xì)胞中Smad7 mRNA和蛋白表達(dá)水平升高，ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)轉(zhuǎn)染HPV16 E7后的A431細(xì)胞TGFβ1的分泌水平升高。 3.WST-1和Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，

8、HPV16 E7過表達(dá)能夠促進(jìn)A431細(xì)胞的生長，增加A431細(xì)胞的遷移和侵襲性。流式細(xì)胞儀檢測還發(fā)現(xiàn)高表達(dá)HPV16 E7可加速A431細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，使S期細(xì)胞數(shù)目增多。 4.Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HPV16 E7過表達(dá)能夠下調(diào)A431細(xì)胞中Smad4的表達(dá)，上調(diào)PCNA和EGFR蛋白的表達(dá)水平。免疫熒光和激光共聚焦實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)了HPV16 E7可影響Smad4蛋白的亞細(xì)胞定位，使Smad4出現(xiàn)胞核

9、到胞漿的轉(zhuǎn)位。 5.成功構(gòu)建了Smad7干擾載體- pcDNA6.2-miR-Smad7干擾質(zhì)粒。該質(zhì)粒被轉(zhuǎn)染至A431細(xì)胞后特異性下調(diào)了細(xì)胞中Smad7的表達(dá)。進(jìn)一步進(jìn)行WST-1和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Smad7沉默可減緩A431細(xì)胞增殖速度，減弱該腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，Smad7沉默能夠使A431細(xì)胞的細(xì)胞周期減慢，凋亡尤其是早期凋亡增加。 6.Westem blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示

10、，Smad7沉默后A431細(xì)胞的TGFpRI、Smad4和Bax的表達(dá)水平較對照組增加，PCNA、C-myc和EGFR蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。Bc1-2、Smadl/2/3和p-Smad2/3蛋白的表達(dá)水平未有明顯變化。免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，Smad7沉默增加了Smad4蛋白向胞核內(nèi)的聚集。 7.通過皮下注射腫瘤細(xì)胞懸液的方法分別構(gòu)建了A431細(xì)胞BALB/C裸鼠荷瘤模型和Smad7沉默的A431細(xì)胞BALB/C裸鼠

11、荷瘤模型，蘇木素伊紅染色顯示移植瘤具有表皮鱗癌的組織病理學(xué)特征。Smad7沉默的A431細(xì)胞BALB/C裸鼠荷瘤模型組的移植瘤生長速度較對照組(Smad7未沉默的A431細(xì)胞BALB/C裸鼠荷瘤模型組)移植瘤的生長速度減慢。應(yīng)用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)，Smad7沉默能夠使A431細(xì)胞的核漿比例有所下降并誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和凋亡。 研究結(jié)論: HPV16 E7是皮膚鱗癌發(fā)生的一個(gè)獨(dú)立性因素，其存在具有增強(qiáng)皮膚鱗癌淋巴