HPV16型E7抗原B細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)與鑒定.pdf

1、目的:
　　 1.預(yù)測(cè)人乳頭瘤病毒(Humanp papilloma virus,HPV)16型E7蛋白的B細(xì)胞表位,可為其單克隆抗體的制備及表位疫苗設(shè)計(jì)等研究提供理論依據(jù)。
　　 2.通過(guò)應(yīng)用計(jì)算機(jī)分析方案預(yù)測(cè),獲得HPV16 E7蛋白候選B細(xì)胞表位,并用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案合成多肽,同時(shí)進(jìn)行純化、純度分析,用于動(dòng)物免疫。
　　 3.將純化的合成多肽與弗氏完全佐劑完全乳化后分別免疫Balb/c小鼠,制備血清抗體,采

2、用間接ELISA方法鑒定合成多肽的免疫原性。并用HPV16陽(yáng)性的宮頸癌組織中的HPV16病毒蛋白作為包被抗原,檢測(cè)合成肽免疫后小鼠產(chǎn)生的血清抗體的效價(jià),以進(jìn)一步探討HPV16 E7蛋白候選B細(xì)胞表位誘導(dǎo)抗體與HPV抗原結(jié)合能力,篩選出HPV16E7蛋白的優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位,為高危型HPV16感染肽疫苗的研制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1.靶抗原HPV16 E7蛋白氨基酸序列摘自GenBank,采用親水性方案、柔韌性方

3、案、抗原指數(shù)方案及表面可能性方案綜合預(yù)測(cè)HPV16 E7蛋白的B細(xì)胞表位,確定候選的B細(xì)胞表位。
　　 2.運(yùn)用標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案合成多肽,合成的多肽經(jīng)RP-HPLC純化及純度分析,并用質(zhì)譜進(jìn)行定性鑒定。
　　 3.為鑒定合成的候選表位肽的免疫原性,以合成肽免疫Balb/c小鼠,進(jìn)行免疫效果評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)組(10只/組)分別以3條合成的多肽為免疫原,對(duì)照組用蒸餾水,與弗氏完全佐劑按100μg:1ml完全乳化后在小鼠腋下、腹股溝

4、及腹腔多點(diǎn)注射,于0、2、4周共注射3次,首次免疫后第1、3、5周小鼠眶靜脈放血采集并制備免疫血清抗體,采用間接ELISA方法進(jìn)行測(cè)定3條多肽在不同免疫時(shí)間的抗體效價(jià)、免疫原性。
　　 4.收集人宮頸癌標(biāo)本,篩選出HPV16陽(yáng)性的標(biāo)本,超聲破膜后提取HPV病毒蛋白,包被酶聯(lián)板與多肽誘導(dǎo)Balb/c小鼠產(chǎn)生的抗體反應(yīng),檢測(cè)HPV16 E7蛋白候選B細(xì)胞表位誘導(dǎo)抗體與HPV抗原結(jié)合能力。
　　 結(jié)果:
　　 1.四種

5、計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)方案分別預(yù)測(cè)出4條、2條、4條、3條抗原肽表位,綜合分析評(píng)估,確定P1(HPV16 E714-21)、P2(HPV16 E726-37)、P3(HPV16 E744-51)為HPV16 E7抗原候選B細(xì)胞表位。
　　 2.合成的候選表位多肽經(jīng)RP-HPLC純化及純度分析,合成肽的純度均大于90％,經(jīng)質(zhì)譜分析合成肽的分子量測(cè)定值與理論值相符。
　　 3.合成的3條多肽免疫Balb/c小鼠后均可明顯誘導(dǎo)小鼠血清抗體

6、滴度升高。經(jīng)間接ELISA方法檢測(cè),候選表位肽均能刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體；抗體效價(jià)隨免疫次數(shù)增加而升高。
　　 4.人HPV16陽(yáng)性的宮頸癌組織中HPV抗原與P1肽和P2肽誘導(dǎo)Balb/c小鼠產(chǎn)生的抗體呈陽(yáng)性反應(yīng),與P3肽產(chǎn)生的抗體不呈陽(yáng)性反應(yīng)。
　　 結(jié)論:
　　 1.預(yù)測(cè)并篩選了3個(gè)可能的HPV16 E7蛋白B細(xì)胞表位。
　　 2.通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)Fmoc方案成功合成了3條多肽,經(jīng)RP-HPLC純化及純度分析,并采