HPV18E7抗原HLA—A2限制性CTL表位的初步篩選及鑒定.pdf

1、目的：HPVl8為宮頸癌的第二大病原體,主要與宮頸腺癌相關(guān),由于HPV18E7蛋白是特異性的腫瘤抗原,作為一種理想的靶抗原在免疫治療研究中倍受重視.本研究中,我們通過計算機輔助算法來篩選HPV18E7抗原的HLA-A2限制性細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic TLymphocyte,CTL)表位,并通過體外細胞培養(yǎng)進一步鑒定預測的CTL表位能否誘導抗原肽特異性CTL產(chǎn)生,為制備針對HPV18感染的治療性疫苗提供候選表位. 方

2、法： 1、采用超基序、多項式和量化基序方案相結(jié)合的方法,對靶抗原HPV18E7的HLA-A2限制性細胞毒性T淋巴細胞表位進行預測,確定候選的CTL表位. 2、采用標準的Fmoc方案合成多肽,合成的多肽經(jīng)RP-HPLC純化及純度分析,并用質(zhì)譜進行定性鑒定. 3、T2細胞結(jié)合試驗,用合成的抗原肽與TAP缺陷細胞系T2共孵育,并用PBS作為對照,用FTFC-鼠抗人HLA-A2單克隆抗體檢測T2細胞表面HLA-A2分子的

3、平均熒光強度,來確定合成的抗原肽是否與HLA-A2分子具有親和力. 4、為了鑒定合成的抗原肽的免疫原性,實驗組:用合成的抗原肽負荷外周血單個核細胞(PBMC)及T2細胞制備抗原呈遞細胞:對照組:采用無關(guān)多肽(}tBVc<,17-28>)負荷外周血單個核細胞(PBMC)及T2細胞制備抗原呈遞細胞.重復刺激HLA-A2正常健康供者的外周血淋巴細胞(PBL),1周1次,共3次.分別在第1輪刺激后和第3輪刺激后,采用RPE標記的抗原肽特

4、異性五聚體和FTFC標記的CD8<'+>單克隆抗體通過流式細胞儀檢測抗原肽所誘導產(chǎn)生的抗原肽特異性CTL的頻率. 結(jié)果： 1、三種方案分別預測出5條、1條和6條抗原肽表位,綜合三種預測方案預測結(jié)果,確定HPVl8E7<,7-15>為候選合成表位. 2、多肽經(jīng)RP-HPLC純化及純度分析,合成肽的純度大于95﹪,經(jīng)質(zhì)譜分析合成肽的分子量測定值與理論值相符. 3、存T2細胞抗原肽結(jié)合試驗中,合成的抗原肽能提高

5、T2細胞表面HLA-A2分子的表達,表明該抗原肽是HLA-A2的配體,能與HLA-A2分子形成穩(wěn)定的復合物. 4、在流式細胞儀檢測中,HLA-A2陽性正常供者外周血淋巴細胞PBL接受抗原肽(HPV18 E7<,7-15>)負荷自身PBMC的第1輪刺激后,所選淋巴細胞群中CD8<'+>五聚體<'+>雙陽性的CTI細胞為1.87﹪,繼續(xù)接受抗原肽HPV18E7<,7-15>負荷的T2細胞后2輪刺激,所選淋巴細胞群中CD8<'+>五聚

6、體<'+>雙陽性的CTL細胞增至15.73﹪;而對照組中未檢出抗原肽特異性的CTL細胞增殖,表明抗原肽HPV18E7<,7-15>能夠誘導正常PBL中特異性CTL的增殖. 結(jié)論： 1、三種預測方案聯(lián)合應用可提高預測效率,避免了在研究HPV18E7抗原表位時盲目合成多肽. 2、在體外試驗中我們鑒定了所合成的高純度抗原肽HPV18E7<,7-15>能夠誘導產(chǎn)生抗原肽特特性CTL增殖,具有良好的免疫原性.因此抗原肽HP