結(jié)核分枝桿菌抗原HLA-A-0201限制性CTL表位鑒定及在活動(dòng)性肺結(jié)核中的診斷應(yīng)用.pdf

1、目的：⑴鑒定結(jié)核分枝桿菌抗原PPE68和MPT63特異性HLA-A*0201限制性CTL表位；⑵探討所鑒定的CTL表位在活動(dòng)性肺結(jié)核疾病中的診斷應(yīng)用價(jià)值。
　　方法：①候選CTL表位的合成：采用T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)軟件SYFPEITHI和PAProc預(yù)測(cè)結(jié)核分枝桿菌獨(dú)有抗原PPE68和MPT63中潛在的受HLA-A*0201限制的CTL表位。②候選CTL表位和HLA-A*0201分子的結(jié)合力的研究：基于T2細(xì)胞株，采用MHC-肽復(fù)合物穩(wěn)

2、定性實(shí)驗(yàn)檢測(cè)候選CTL表位和HLA-A*0201分子的結(jié)合力。③單個(gè)CTL表位免疫HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠，采用ELISPOT檢測(cè)小鼠脾單個(gè)核細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞內(nèi)CTL表位特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞的頻率，采用CTL殺傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠脾細(xì)胞（效應(yīng)細(xì)胞）殺傷負(fù)載CTL表位的脾單個(gè)核細(xì)胞的效應(yīng)。④基于HLA-A*0201陽(yáng)性結(jié)核分枝桿菌感染者及健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（ELISPOT）檢測(cè)PBMC中C

3、TL表位、ESAT-6和CFP-10特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞的頻率，進(jìn)而確定結(jié)核分枝桿菌特異性CTL表位在診斷肺結(jié)核中的敏感性和特異性。
　　結(jié)果：⑴基于預(yù)測(cè)得分及序列在結(jié)核分枝桿菌中的保守性，選擇14條PPE68源性潛在受HLA-A*0201限制的候選CTL表位（PPE6837-45（ALDAQAVEL），PPE685-13（AMPPELNTA），PPE6844-52（ELTARLNSL），PPE68148-156（ALAM

4、EVYQA），PPE6826-34（AAAAGWQTL），PPE68133-141（ALTEMDYFI），PPE68166-174（KLEPMASIL），PPE68126-134（GINTIPIAL），PPE6864-73（ALAAATPMVV），PPE68299-308（QLPPAATQTL），PPE68105-114（SLPEIAANHI），PPE68140-149（FIRMWNQAAL），PPE68277-286（LIEKPVAP

5、SV）， PPE68200-209（LLRAESLPGA）。）和10條MPT63源性潛在受HLA-A*0201限制的候選CTL表位（MPT635–14（TMIKTAVAVV），MPT6310–19（AVAVVAMAAI），MPT6318–26（AIATFAAPV），MPT6320–28（ATFAAPVAL），MPT6329–37（AAYPITGKL），MPT6342–50（MTDTVGQV），MPT6351–59（VLGWKVSDL），

6、MPT6374–82（QVWEATATV），MPT6384–93（AIRGSVTPAV），MPT63146–154（AMNNGMEDL）。），委托生物公司合成，純度大于95％。⑵在13條PPE68源性的HLA-A*0201高結(jié)合力肽中，除PPE6837–45和PPE6844–52外，其它11條CTL表位免疫的HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠的脾和淋巴結(jié)細(xì)胞內(nèi)均存在表位特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞，這些效應(yīng)細(xì)胞能夠殺傷負(fù)載相同CTL表位的脾

7、單個(gè)核細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞。14條候選表位中，PPE68299–308免疫的轉(zhuǎn)基因小鼠中脾單個(gè)核細(xì)胞和淋巴結(jié)細(xì)胞中表位特異性分泌IFN-γ的細(xì)胞的頻率最高[（307±23）SFCs/5×105脾單個(gè)核細(xì)胞；（174±21）SFCs/2×105淋巴結(jié)細(xì)胞]。⑶在5條MPT63源性HLA-A*0201高結(jié)合力肽中，MPT6318–26免疫HLA-A*0201轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)產(chǎn)生了最高水平的表位特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞反應(yīng)[（126±20） S

8、FCs/2×105脾單個(gè)核細(xì)胞，(79±12)SFCs/2×105淋巴結(jié)細(xì)胞]。MPT6318–26特異性T細(xì)胞對(duì)負(fù)載CTL表位的脾單個(gè)核細(xì)胞的殺傷率最高（效靶比E:T=10:1時(shí)，殺傷率為57.93±9.46%），但是其他的肽未誘導(dǎo)顯著性的免疫反應(yīng)。⑷在14條PPE68源性肽中，9條候選表位（PPE68148–156，PPE68133–141，PPE68166–174， PPE68126–134，PPE6864–73，PPE68200

9、–209，PPE68105–114，PPE68140–149和PPE68277–284）都可以被至少50%的結(jié)核分枝桿菌感染者的PBMC識(shí)別，表現(xiàn)為PBMC中存在高水平上述肽特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞。88%和84%的人的PBMC可以識(shí)別ESAT-6和CFP-10。（2）在10條MPT63源性肽中，5條候選表位（MPT635–14，MPT6318–26，MPT6342–50， MPT6374–82，MPT6384–93）分別被63%、

10、73%、45%、60%和68%被結(jié)核分枝桿菌感染者PBMC識(shí)別，表現(xiàn)為PBMC中存在高水平的上述肽特異性分泌IFN-γ的T細(xì)胞。70%和73%的人的PBMC可以識(shí)別ESAT-6和CFP-10。
　　結(jié)論：①17條候選表位（PPE685-13、 PPE68148-156、PPE6826-34、 PPE68133-141、PPE68166-174、PPE68126-134、PPE6864-73、 PPE68299-308、PPE681

11、05-114、PPE68140-149、PPE68277-286、PPE68200-209、MPT635–14、 MPT6318–26、 MPT6342–50、 MPT6374–82、 MPT6384–93）為結(jié)核分枝桿菌抗原源性HLA-A*0201限制性CTL表位。②9條CTL表位（PPE68126–134、PPE68133–141、PPE68140–149、PPE68148–156、MPT635–14、MPT6318–26、MPT6