漢族白癜風患者HLA-A-0201限制性CTL表位的篩查與鑒定.pdf

1、白癜風是由表皮局部功能性黑素細胞進行性破壞、脫失所致,全球平均發(fā)病率為0.5％-2%。白癜風的黑素細胞損傷可由多種因素共同作用所致,其中氧化應激損傷及自身免疫機制是黑素細胞破壞的主要原因。細胞內(nèi)外的活性氧簇(ROS)的蓄積及清除障礙可引起氧化應激,直接引起黑素細胞損傷乃至凋亡。而自身免疫機制,尤其是細胞免疫在黑素細胞的破壞中起著至關(guān)重要的作用。對皮損局部以及外周循環(huán)中的T細胞進行分析,發(fā)現(xiàn)其可以特異性地識別黑素細胞相關(guān)抗原,并可殺傷同種

2、HLA分型的黑素細胞,提示細胞免疫機制在白癜風黑素細胞損傷中發(fā)揮重要作用。抗原識別作為整個細胞免疫反應的起始環(huán)節(jié)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。作為白癜風患者中常見的HLA分型,HLA-A*0201限制性的T細胞抗原表位的鑒定是白癜風的細胞免疫機制研究一項重要基礎性工作。上世紀90年代以來,國外通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及
　　cDNA-iCOS方法明確了黑素瘤中HLA-A*0201限制性的T淋巴細胞特異性識別的黑素瘤表達的抗原。黑素細胞分化抗原主要集中在以下

3、蛋白中:酪氨酸酶(tyrosinase)、gp100以及MART-1。黑素瘤患者注射特異性識別以上黑素瘤抗原表位的T淋巴細胞可以殺傷黑素瘤細胞,一定程度上緩解黑素瘤患者的病情。研究發(fā)現(xiàn),白癜風患者外周血單個核細胞也可特異性地識別上述黑素瘤抗原表位,活化外周血T淋巴細胞,產(chǎn)生IFN-γ等細胞因子。證實這些抗原表位可能是白癜風發(fā)病中的自身抗原,為進一步研究白癜風的自身免疫機制提供了線索。
　　我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn):白癜風患者的黑素

4、細胞抗氧化應激能力異常、易于凋亡;白癜風患者體內(nèi)抗氧化酶如谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、過氧化氫酶、甲硫氨酸硫氧化物還原酶等存在基因突變,引起其功能異常;白癜風患者黑素細胞中Nrf2/ARE抗氧化應激通路功能缺陷致使其易發(fā)生ROS損傷。多種因素共同作用導致黑素細胞抗氧化能力降低,ROS產(chǎn)生增多。ROS引起黑素細胞功能和結(jié)構(gòu)異常,胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)位至細胞外膜,并被氧化修飾,容易被免疫細胞識別吞噬。氧化應激狀態(tài)下黑素細胞誘導黑素細胞膜表面鈣網(wǎng)蛋白(CRT)和內(nèi)

5、質(zhì)網(wǎng)蛋白57(Erp57)聚集,可增強黑素細胞的免疫原性,活化抗原提呈細胞。白癜風自身抗原如tyrosinase、MART-1、gp100等在氧化應激狀態(tài)下發(fā)生膜外暴露、氨基酸修飾,導致其免疫原性改變,引起自身免疫細胞對其的識別、引發(fā)下游自身免疫反應。
　　基于本課題組的研究基礎,綜合國內(nèi)外文獻,我們提出了系統(tǒng)的白癜風發(fā)病機制假說:在遺傳背景基礎上,白癜風患者黑素細胞抗氧化能力降低,氧化應激引起黑素細胞抗原暴露并誘導特異性自身免疫

6、應答,破壞黑素細胞并形成“瀑布式效應”。氧化應激損傷在黑素細胞破壞中為始動因素,自身免疫應答損毀黑素細胞則是白癜風急速發(fā)展的重要原因。因此,本項目擬在前期研究基礎上,篩選黑素細胞自身抗原特異性T細胞表位、構(gòu)建致病抗原/HLA-A*0201四聚體,明確白癜風自身免疫發(fā)病機制中的自身抗原,闡明自身抗原特異性CTL殺傷黑素細胞的關(guān)鍵啟動機制。通過明確氧化應激打破免疫耐受后啟動自身免疫應答的細胞和分子機制,有望闡明上述發(fā)病機制假說中有待證明的關(guān)

7、鍵環(huán)節(jié),對系統(tǒng)認識白癜風臨床現(xiàn)象及明確防治策略將產(chǎn)生重大影響。
　　方法:
　　1.閱讀文獻,明確白癜風中HLA-A*0201限制性抗原表位:tyrosinase369-377,3D:YMDGTMSQV、gp100209-217,2M:IMDQVPFSV、gp100280-288,9V:YLEPGPVTV、MART-126-35,2L: ELAGIGILTV、MART-126-35:EAAGIGILTV,合成上述表位肽段后,

8、選取進展期HLA-A*0201白癜風患者并分離其外周血單個核細胞,利用ELISPOT技術(shù)明確患者淋巴細胞針對特異性抗原肽段的免疫反應。并將治療前后的ELISPOT實驗結(jié)果相比較,明確免疫反應水平與疾病進展有無關(guān)聯(lián)。
　　2.利用軟件,預測出tyrosinase、gp100、MART-1中可能的HLA-A*0201限制性抗原表位。篩選進展期HLA-A*0201白癜風患者,將分離的外周血單個核細胞與抗原肽段共同孵育,利用ELISPOT

9、技術(shù)確定淋巴細胞可特異性識別的抗原肽段。將篩選出的肽段進行T2細胞結(jié)合力實驗、細胞因子檢測、四聚體流式以及激光共聚焦實驗等功能學驗證。
　　結(jié)果:
　　1.48位進展期HLA-A*0201白癜風患者針對上述5條白癜風相關(guān)肽段的特異性T細胞頻率分別為4.63/2×105 PBMC、7.44/2×105 PBMC、13.42/2×105 PBMC、5.60/2×105 PBMC、4.71/2×105 PBMC。其中37位患者治療

10、1月后,對gp100280-288,9V(YLEPGPVTV)肽段的細胞免疫水平顯著下降。
　　2.綜合軟件BIMAS、SYFPEITHI的預測結(jié)果,在tyrosinase中篩選出可能的抗原肽段51條,gp100中可能的抗原肽段106條,MART-1中可能的抗原肽段13條。每10條左右肽段組成一個肽池,用肽池分別刺激進展期HLA-A*0201白癜風患者外周血單個核細胞。篩選出的陽性肽池有:tyrosinase(3號、5號),gp1

11、00(12號、13號),MART-1(無)。
　　3.用3個陽性肽池中的肽段逐一刺激白癜風患者外周血單個核細胞,利用ELISPOT實驗最終確定陽性肽段有:①Gp100 P-112 QILKGGSGT;②tyrosinase P-41 AMVGAVLTA;③Gp100 P-118 QLIMPGQEA;④tyrosinase P-24 SSADVEFCL;⑤tyrosinase P-28 TLEGFASPL;⑥Gp100 P-119

12、TLEGFASPL。
　　4.ELISA實驗檢測陽性肽段刺激患者外周血單個核細胞后產(chǎn)生的胞外細胞因子,證實P-112肽段刺激患者外周血單個核細胞產(chǎn)生高水平IFN-γ,其余陽性肽段刺激后未見顯著升高的細胞因子。親和力實驗、四聚體的流式及激光共聚焦實驗均未見陽性反應。
　　結(jié)論:
　　1.漢族白癜風患者淋巴細胞對黑素細胞自身抗原表位存在特異性細胞免疫應答,這種應答水平與疾病活動性相關(guān)。
　　2.在漢族HLA-A*02