Survivin HLA-A2+限制性CTL表位篩選、鑒定及其免疫學效應研究.pdf

1、目的：表位是抗原中能被免疫細胞特異性識別的線性片段或空間構象性結構，是引起免疫應答和免疫反應的基本單位，鑒定合適的抗原表位是誘導產生有效腫瘤免疫應答的關鍵。本研究利用三種計算機算法篩選Survivin抗原HLA-A2+限制性CTL表位；利用不同親和力的表位肽分別誘導CTL，探討其免疫學效應和殺瘤特性。
　　 方法：采用超基序、量化基序法和蛋白酶體裂解法相結合對靶抗原SurvivinHLA-A2+限制性CTL表位進行預測篩選；用流

2、式細胞儀檢測侯選表位肽與T2細胞結合后熒光強度變化，應用HLA-A2結合實驗和流式細胞術檢測候選表位肽的結合親和力，以熒光系數(shù)FI(fluorescence index)表示；根據(jù)HLA-A2解離實驗和流式細胞術檢測候選肽的穩(wěn)定性，以復合物解離50％的時間DC50(dissociation complex50％)表示。分別用篩選出的高親和力、中等親和力及低親和力表位肽體外誘導CTL并用酶聯(lián)免疫斑點(ELISPOT)法檢測CTL產生分泌I

3、FN-γ的能力；用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測CTL的殺瘤能力。
　　 結果：1.用超基序法、量化基序法和蛋白酶體裂解法篩選了九條Survivin九肽CTL表位，分別是：20STFKNWPFL28(SV20-28)、23KNWPFLEGC31(SV23-31)、96LTLGEFLKL104(SV96-104)、6LPPAWQPFL14(SV6-14)、33CTPERMAEA41(SV33-41)、46CPTENEPDL54(S

4、V46-54)、130KVRRAIEQL138(SV130-138)、37RMAEAGFIH45(SV37-45)、88SVKKQFEEL96(SV88-96)。2.親和力分析顯示：SV20-28、SV96-104、SV130-138、SV23-31的熒光指數(shù)(Fluorescence Index，F(xiàn)I)分別為8.61、6.88、5.89、3.81；SV33-41、SV6-14、SV46-54、SV37-45、SV88-96的FI分別為

5、0.31、-0.29、-0.4、-0.16和-0.03；穩(wěn)定性分析結果為：SV20-28、SV96-104、SV130-138，DC50(dissociationcomplex50)＞8h；SV23-31 DC50為4-6h；其余表位肽DC50小于4小時。結果提示：SV20-28、SV96-104、SV130-138為高親和力表位肽；SV23-31為中等親和力表位肽；SV33-41、SV6-14、SV46-54、SV37-45、SV88

6、-96為低親和力表位肽。3.Survivin高親和性表位SV20-28和中等親和力表位SV23-31負載DC誘導的CTL能產生分泌IFN-γ細胞，在ELISPOT試驗中效靶比為1∶1時產生的斑點數(shù)分別為183.42±16.07、76.08±8.42，顯著高于陰性對照組斑點數(shù)，P＜0.05；而低親和力表位SV88-96誘導的CTL未能產生明顯的IFN-γ分泌細胞。高親和力及中等親和力表位肽誘導的CTL能以MHC-I限制方式殺傷Surviv

7、in陽性細胞，在效靶比為：50∶1、25∶1、12.5∶1時的殺傷率分別分別為(62.40±5.16)％、(44.0±2.32)％、(26.53±1.07)％和(33.42±4.76)％、(25.16±2.64)％、(15.83±1.57)％，顯著高于陰性對照組：(5.59±0.16)％、(4.76.0±0.32)％、(2.93±0.07)％；而低親和力表位肽SV88-96誘導的免疫細胞對靶細胞沒有明顯的殺傷作用。
　　 結論：