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文檔簡介
1、目的:表位是抗原中能被免疫細(xì)胞特異性識(shí)別的線性片段或空間構(gòu)象性結(jié)構(gòu),是引起免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)的基本單位,鑒定合適的抗原表位是誘導(dǎo)產(chǎn)生有效腫瘤免疫應(yīng)答的關(guān)鍵。本研究利用三種計(jì)算機(jī)算法篩選Survivin抗原HLA-A2+限制性CTL表位;利用不同親和力的表位肽分別誘導(dǎo)CTL,探討其免疫學(xué)效應(yīng)和殺瘤特性。
方法:采用超基序、量化基序法和蛋白酶體裂解法相結(jié)合對(duì)靶抗原SurvivinHLA-A2+限制性CTL表位進(jìn)行預(yù)測(cè)篩選;用流
2、式細(xì)胞儀檢測(cè)侯選表位肽與T2細(xì)胞結(jié)合后熒光強(qiáng)度變化,應(yīng)用HLA-A2結(jié)合實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)候選表位肽的結(jié)合親和力,以熒光系數(shù)FI(fluorescence index)表示;根據(jù)HLA-A2解離實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)候選肽的穩(wěn)定性,以復(fù)合物解離50%的時(shí)間DC50(dissociation complex50%)表示。分別用篩選出的高親和力、中等親和力及低親和力表位肽體外誘導(dǎo)CTL并用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)法檢測(cè)CTL產(chǎn)生分泌I
3、FN-γ的能力;用乳酸脫氫酶(LDH)釋放法檢測(cè)CTL的殺瘤能力。
結(jié)果:1.用超基序法、量化基序法和蛋白酶體裂解法篩選了九條Survivin九肽CTL表位,分別是:20STFKNWPFL28(SV20-28)、23KNWPFLEGC31(SV23-31)、96LTLGEFLKL104(SV96-104)、6LPPAWQPFL14(SV6-14)、33CTPERMAEA41(SV33-41)、46CPTENEPDL54(S
4、V46-54)、130KVRRAIEQL138(SV130-138)、37RMAEAGFIH45(SV37-45)、88SVKKQFEEL96(SV88-96)。2.親和力分析顯示:SV20-28、SV96-104、SV130-138、SV23-31的熒光指數(shù)(Fluorescence Index,F(xiàn)I)分別為8.61、6.88、5.89、3.81;SV33-41、SV6-14、SV46-54、SV37-45、SV88-96的FI分別為
5、0.31、-0.29、-0.4、-0.16和-0.03;穩(wěn)定性分析結(jié)果為:SV20-28、SV96-104、SV130-138,DC50(dissociationcomplex50)>8h;SV23-31 DC50為4-6h;其余表位肽DC50小于4小時(shí)。結(jié)果提示:SV20-28、SV96-104、SV130-138為高親和力表位肽;SV23-31為中等親和力表位肽;SV33-41、SV6-14、SV46-54、SV37-45、SV88
6、-96為低親和力表位肽。3.Survivin高親和性表位SV20-28和中等親和力表位SV23-31負(fù)載DC誘導(dǎo)的CTL能產(chǎn)生分泌IFN-γ細(xì)胞,在ELISPOT試驗(yàn)中效靶比為1∶1時(shí)產(chǎn)生的斑點(diǎn)數(shù)分別為183.42±16.07、76.08±8.42,顯著高于陰性對(duì)照組斑點(diǎn)數(shù),P<0.05;而低親和力表位SV88-96誘導(dǎo)的CTL未能產(chǎn)生明顯的IFN-γ分泌細(xì)胞。高親和力及中等親和力表位肽誘導(dǎo)的CTL能以MHC-I限制方式殺傷Surviv
7、in陽性細(xì)胞,在效靶比為:50∶1、25∶1、12.5∶1時(shí)的殺傷率分別分別為(62.40±5.16)%、(44.0±2.32)%、(26.53±1.07)%和(33.42±4.76)%、(25.16±2.64)%、(15.83±1.57)%,顯著高于陰性對(duì)照組:(5.59±0.16)%、(4.76.0±0.32)%、(2.93±0.07)%;而低親和力表位肽SV88-96誘導(dǎo)的免疫細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞沒有明顯的殺傷作用。
結(jié)論:
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