乳腺癌相關(guān)抗原ROR1H-2Kd限制性CTL表位疫苗制備及其抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：預(yù)測(cè)鑒定腫瘤抗原ROR1的H-2Kd限制性CTL表位，制備胸腺肽α1修飾的表位多肽疫苗，觀察多肽疫苗的抗腫瘤作用，為乳腺癌的免疫治療奠定基礎(chǔ)。
　　方法：查詢NCBI蛋白質(zhì)庫(kù)，獲得小鼠腫瘤抗原ROR1的氨基酸序列，利用表位預(yù)測(cè)軟件BIMAS及 SYFPEITHI對(duì)小鼠腫瘤抗原 ROR1的H-2Kd限制性CTL表位進(jìn)行預(yù)測(cè)；根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，合成和純化候選表位肽。流式細(xì)胞儀檢測(cè)候選表位肽與H-2Kd分子的親和力。選取親和力較高的候

2、選多肽與胸腺肽α1偶聯(lián)制備多肽疫苗ROR1-Tα1。ELISA法檢測(cè)ROR1-Tα1體外刺激小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生釋放的細(xì)胞因子IL-12以及IFN-γ。為研究多肽疫苗對(duì)小鼠的免疫保護(hù)作用，先用ROR1-Tα1免疫BALB/c小鼠三次，每周一次。首次免疫后第7天，在小鼠右側(cè)腋窩接種4T1乳腺癌細(xì)胞。末次免疫后3周將小鼠處死，剝離腫瘤，觀察腫瘤大小。
　　結(jié)果：使用表位預(yù)測(cè)軟件BIMAS及SYFPEITHI進(jìn)行預(yù)測(cè)，選取4條表位候選肽ROR

3、1716-724（DCPPRMYSL），ROR1269-277（SNPMILMRL），ROR1788-796（NYMFPSQGI），ROR1591-599（DFLHIAIQI）；合成上述4條表位多肽，高效液相色譜法分析顯示多肽純度≥95％。肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，隨著表位多肽濃度增加，其與MHC-I類分子的親和力亦逐漸增強(qiáng)，當(dāng)表位多肽濃度達(dá)到30μmol/L的時(shí)候，4條表位多肽的熒光系數(shù)均>1.5，提示具有較高的親和力。選取兩個(gè)預(yù)測(cè)軟件分析結(jié)果

4、重疊的候選表位肽ROR1591-599（DFLHIAIQI）與胸腺肽α1進(jìn)行偶聯(lián)合成ROR1-Tα1多肽疫苗。ELISA結(jié)果表明ROR1-Tα1疫苗能有效促進(jìn)小鼠T淋巴細(xì)胞的IL-12及IFN-γ的合成分泌，體外具有生物學(xué)活性。免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ROR1-Tα1組腫瘤生長(zhǎng)速度較對(duì)照組生長(zhǎng)慢且腫瘤平均重量明顯小于對(duì)照組，提示ROR1-Tα1多肽疫苗對(duì)荷瘤小鼠具有明顯的免疫保護(hù)效應(yīng)。
　　結(jié)論：通過預(yù)測(cè)軟件獲得與H-2Kd分子具有