胃腸腫瘤相關(guān)抗原CTL表位嵌合基因的克隆和表達(dá).pdf_第1頁(yè)
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1、目的：1.利用人乳頭瘤病毒(HPV)主要結(jié)構(gòu)蛋白Ll能自組裝形成病毒樣顆粒(VLPs)并可作為抗原釋放載體的特點(diǎn),構(gòu)建HPV6b11/MAGE-A3/CEA691/Her-2 CTL表位的重組DNA,并在真核表達(dá)系統(tǒng)昆蟲(chóng)細(xì)胞s19內(nèi)表達(dá)該嵌合蛋白,為進(jìn)一步研究其免疫原性、制備胃腸腫瘤嵌合蛋白疫苗奠定了基礎(chǔ). 2.將MAGE-A3、CEA691、Her-2的CTL表位DNA克隆至優(yōu)化后的HPV6b11基因羧基端,構(gòu)建優(yōu)化HPV6b

2、11/MAGE-3,CEA691/Her-2 CTL表位的重組DNA,并真核表達(dá)系統(tǒng)Cos-7細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)其表達(dá)情況,為研究?jī)?yōu)化后HPV L1載體表達(dá)情況及制備胃腸腫瘤核酸疫苗奠定了理論基礎(chǔ). 方法：1.選擇pFastBac<'TM>/HPV6b11/MAGE-A3-CTL表位(MAGE-A3 899～924,氨基酸序列:YLEYRQVPG)重組質(zhì)粒和CEA691-CTL表位(CEA691 2185～2212,氨基酸序列:IMIG

3、VLVGV)及Her-2 CTL表位(1278～1305,氨基酸序列:KIFGSLAFL),通過(guò)PCR擴(kuò)增出HV6b11/MAGE-A3/CEA69l/Her-2 CTL表位重組DNA,克隆入pFastBac<'TM>載體,構(gòu)建pFastBac<'TM>1/HPV6b L1/MAGE-A3/CEA691/Her-2-CTL表位重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10,構(gòu)建Bacmid/HPV6bL1/MAGE-A3/CEA691/Her-2-CT

4、L表位重組桿狀病毒,將重組桿狀病毒轉(zhuǎn)染sf-9昆蟲(chóng)細(xì)胞,表達(dá)嵌合蛋白,經(jīng)SDS-PAGE電泳及Westem-blot分析鑒定正確,超離純化出嵌合蛋白.2.選擇密碼子的優(yōu)化HPV6BL1、MAGE-A3 CTL表位(MAGE-A3 899-924,氨基酸序列:YLEYRQVPG)、CEA CTL表位(CEA691位于2185-2212,氨基酸序列:IMIGVLVGV)和Her-2 CTL表位(Her-2/neu 1278-1305,氨基酸

5、序列:KIFGSLAFL),通過(guò)PCR擴(kuò)增出優(yōu)化HPV6b11/MAGE-A3/CEA691/Her-2 CTL表位重組DNA,克隆入pCDNA3.1載體,構(gòu)建pCDNA3.1/優(yōu)化HPV6b11/MAGE-A3/CEA691/Her-2 CTL細(xì)胞表位重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞,經(jīng)SDS-PAGE電泳及Western-blotting分析重組質(zhì)粒的表達(dá)情況. 結(jié)果：1.成功構(gòu)建了HPPV6bl1,MAGE-A3,CEA691

6、/Her-2 CTL表位重組DNA采用PCR成功擴(kuò)增出HPV6bl1/MAGE-A3/CEA691/Her-2 CTL表位重組DNA,成功構(gòu)建pFas<'TM>tBacTM1/HPV6bL1/MAGE-A3/CEA691/Her-2 CTL表位重組質(zhì)粒和Baemid/HPV6bL1/MAGE-A3/CEA691/Her-2 CTL表位重組桿狀病毒.2.成功制備了HPV6bl1/MAGE-A3/CEA691/Her-2 CTL表位嵌合蛋白

7、重組桿狀病毒成功轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞,SDS-PAGE電泳及Western-blot分析能構(gòu)表達(dá)63kd大小.3.超速離心分離純化出目的HPV6bl1/MAGE-A3/CEA691/Her-2 CTL表位嵌合自.4.成功構(gòu)建pCDNA3.1/優(yōu)化HP6bl1/MAGBE-A3/CEA691/Her-2 CTL表位重組質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞后,經(jīng)SDS-PAGE電泳及Westem-blot分析,重組質(zhì)粒能夠在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白. 結(jié)論

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