銀環(huán)蛇蛇毒相關(guān)基因的克隆和表達(dá)研究.pdf

1、本研究利用前期研究中構(gòu)建的pGEX-BgTX(P22-A31)質(zhì)粒在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)并純化后得到了較純的重組α-銀環(huán)蛇毒素同工毒素，得率約為1.225mg/L。用重組蛋白與天然α-銀環(huán)蛇毒素的抗原性一致。重組α-銀環(huán)蛇毒素同工毒素的半致死劑量LD50為1.598mg/kg，約為天然α-銀環(huán)蛇毒素的1/5且有一定的鎮(zhèn)痛藥效，1/4LD50劑量的鎮(zhèn)痛百分率為55-2％，1/8LD50劑量的鎮(zhèn)痛百分率為20.5％，在外周鎮(zhèn)痛作

2、用中呈一定的量效關(guān)系。以上結(jié)果表明，本研究重組表達(dá)的α-銀環(huán)蛇毒素同工毒素(P22-A31)具有與天然α-銀環(huán)蛇毒素相似的生物學(xué)活性。 α-銀環(huán)蛇毒素cDNA序列的多態(tài)性及其引起這種多態(tài)性的原因一直存在爭議。本文從同一銀環(huán)蛇個(gè)體中克隆并測序了5個(gè)α-銀環(huán)蛇毒素基因組序列，又在同一次反轉(zhuǎn)錄的cDNA中克隆神經(jīng)生長因子的cDNA，并通過計(jì)算多個(gè)克隆間的突變情況，與同一體系中得到的12種α-銀環(huán)蛇毒素cDNA序列突變率做比較，并統(tǒng)計(jì)

3、了前人克隆到的多種α-銀環(huán)蛇毒素cDNA序列突變的情況，得出結(jié)論：α-銀環(huán)蛇毒素cDNA序列的多態(tài)性不是由于基因組不同而來的，也不是由RNA編輯造成，很可能是由于反轉(zhuǎn)錄過程，PCR，基因克隆及DNA測序過程人為引入的。 運(yùn)用RACE技術(shù)從銀環(huán)蛇毒腺cDNA中克隆到2個(gè)C型凝集素基因的全長cDNA序列，BML-1和BML-2，其中BML-2是首次從銀環(huán)蛇(Bungarusmulticinctus)中克隆到。并將這2個(gè)蛋白135個(gè)

4、氨基酸的成熟肽部分和137個(gè)氨基酸的成熟肽部分分別連入pET-His載體后在BL21(DE3)plysS中表達(dá)，重組蛋白以包涵體的形式存在，復(fù)性后的重組C型凝集素具有凝集紅細(xì)胞活性。其中由135個(gè)氨基酸組成的重組C型凝集素以單體形式存在，由137個(gè)氨基酸組成的重組C型凝集素有50％以二聚體的形式存在，另50％以單體形式存在。Westernblotting和親和純化結(jié)果表明，天然C型凝集素是以更小分子量的單體形成的二聚體。純化到的4種分子