應(yīng)力與鐵皮石斛的生長及其相關(guān)基因表達(dá)和克隆研究.pdf

1、隨著Bio+X學(xué)科的興起,物理學(xué)與植物學(xué)的交叉與融合已受到國內(nèi)外學(xué)術(shù)界的關(guān)注。國內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn):人為機(jī)械力加載對(duì)植物細(xì)胞的生長、分裂具有顯著的調(diào)控作用,且在適度的應(yīng)力加載下植物細(xì)胞均優(yōu)先性垂直于應(yīng)力矢量的伸長生長。然而,對(duì)于植物細(xì)胞的機(jī)械力信號(hào)感受、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的理解,以及應(yīng)力對(duì)藥用植物的生長代謝及分子表達(dá)調(diào)控有何影響等方面,目前的研究工作都只是提供了零星的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,尚無系統(tǒng)、完整的途徑解釋。
　　本課題以珍貴的藥用植物鐵皮石斛

2、為研究對(duì)象,基于已有的工作基礎(chǔ)及研究方法,利用聲波應(yīng)力加載、生化檢測(cè)、基因篩選克隆、和功能基因的生物信息學(xué)預(yù)測(cè)等多學(xué)科的研究手段和先進(jìn)方法,研究聲波應(yīng)力干預(yù)植物的生長代謝相關(guān)的抗氧化酶系統(tǒng)、代謝產(chǎn)物的含量變化、相關(guān)酶基因片段的擴(kuò)增與表達(dá)、特異表達(dá)基因的篩選克隆及其生物信息學(xué)功能預(yù)測(cè),實(shí)驗(yàn)結(jié)果為揭示物理應(yīng)力對(duì)植物生長代謝調(diào)控機(jī)制提供基礎(chǔ)依據(jù)和直接的分子生物學(xué)證據(jù),為藥用植物代謝產(chǎn)物的提高作新方法的嘗試,為尋找應(yīng)力作用植物的功能基因和功能蛋

3、白作前期工作。
　　本實(shí)驗(yàn)取得的研究結(jié)果如下:
　　1.聲波刺激對(duì)鐵皮石斛生長影響:研究發(fā)現(xiàn),適當(dāng)?shù)穆暡☉?yīng)力(頻率1000Hz、聲強(qiáng)100dB)對(duì)鐵皮石斛組培苗的生長起明顯的促進(jìn)作用,超出一定范圍時(shí)對(duì)其生長有抑制作用,這與本實(shí)驗(yàn)室在菊花和擬南芥等模式植物中的研究結(jié)果相一致。但在測(cè)定聲波刺激對(duì)鐵皮石斛葉、莖、根等不同生長器官的抗氧化性酶活性的影響時(shí)又發(fā)現(xiàn),在應(yīng)力作用下,鐵皮石斛抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)

4、、超氧歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)等幾種主要抗氧化酶的活性普遍得到提高,如葉、莖和根中的APX活性平均提高了15.7％、29.5%和21.5%,CAT活性分別提高了12.3%、8.5%和26.6%;這也顯示,不同的抗氧化酶響應(yīng)應(yīng)力刺激的形式都有所差別。同一種酶,對(duì)聲波應(yīng)力的響應(yīng)在不同生長器官中的差別也較大,如莖的POD活性比根的對(duì)應(yīng)力刺激要敏感,SOD活性根比莖葉反應(yīng)要遲鈍。結(jié)果說明,聲波刺激植物組培苗可能造成植物細(xì)胞活性氧(

5、AOS)迸發(fā),以刺激植物細(xì)胞增殖,促進(jìn)植物生長。推測(cè)AOS在應(yīng)力信號(hào)傳遞的過程中,可能是一種重要的信號(hào)分子。
　　2.聲波刺激對(duì)鐵皮石斛代謝產(chǎn)物含量的影響:在聲波刺激下,鐵皮石斛多糖含量提高較為顯著,刺激組含量均高于對(duì)照組,平均提高了8.8%;總生物堿的含量提高了0.022%;可溶性蛋白質(zhì)含量平均增加了14.4%,其變化呈現(xiàn)逐漸升高后逐漸降低的趨勢(shì);脯氨酸的含量變化呈現(xiàn)波浪態(tài)勢(shì),差異不很顯著;丙二醛含量刺激組較對(duì)照組降低了4.9%

6、。結(jié)果表明,聲波刺激對(duì)鐵皮石斛的代謝產(chǎn)物影響比較顯著,有利于鐵皮石斛多糖的積累,刺激了可溶性蛋白質(zhì)含量的提高,聲波刺激很可能改善了代謝產(chǎn)物關(guān)鍵酶活性,促進(jìn)或抑制相關(guān)代謝產(chǎn)物的含量,從而使植物適應(yīng)應(yīng)力刺激。
　　3.聲波應(yīng)力對(duì)鐵皮石斛POD同工酶基因表達(dá)的影響:應(yīng)力刺激沒有誘導(dǎo)出新的酶帶出現(xiàn),分子雜交結(jié)果與酶譜學(xué)一致。就整體而言,聲波應(yīng)力在一定的時(shí)間內(nèi)能夠增強(qiáng)植物POD基因表達(dá),但對(duì)某一具體POD基因是起促進(jìn)作用還是起抑制作用需要具

7、體分析。
　　4.特異表達(dá)基因的篩選、克隆和測(cè)序:應(yīng)用mRNA差異顯示(DDRT-PCR)、PAGE電泳、銀染和反式Northern點(diǎn)雜交的技術(shù)對(duì)響應(yīng)聲波應(yīng)力的差異表達(dá)基因片段進(jìn)行了篩選、克隆和測(cè)序。在聲波應(yīng)力作用下,鐵皮石斛組培苗刺激組較對(duì)照組總RNA含量提高了3%;共篩選到4條差異性和重復(fù)性較好的基因片段,分別為:SA8、SA5、SG6和CC7。雜交結(jié)果顯示,SA8為聲波應(yīng)力誘導(dǎo)優(yōu)勢(shì)表達(dá)條帶,SA5和SG6為聲波應(yīng)力誘導(dǎo)性特異

8、表達(dá)條帶,CC7為聲波應(yīng)力抑制性表達(dá)條帶。4個(gè)基因克隆片段長分別為:Clone-SA8,552bp;Clone-SA5,390bp;Clone-SG6,408bp;Clone-CC7,496bp。
　　5.克隆片段的核苷酸序列分析:①Clone-SA8基因片段中的18-527核苷酸編碼169個(gè)氨基酸,包含起始密碼子ATG和終止子密碼子TAA,可認(rèn)為是一條較短的全多肽序列;通過Blastp程序在GenBank中搜索蛋白質(zhì)相似性發(fā)現(xiàn),

9、Clone-SA8蛋白與多種動(dòng)物的細(xì)胞分裂周期蛋白相關(guān)蛋白有較高的相似性;在與植物蛋白的序列比對(duì)中,發(fā)現(xiàn)與蓮屬植物(Lotuscorniculatusvar.japonicus)的細(xì)胞周期開關(guān)蛋白(cellcycleswitchproteinCCS52A,GenBank登錄號(hào)為AAY58271.1)在氨基酸水平上具有31%的一致性,50%的相似性;與擬南芥(Arabidopsisthaliana)的Srw1類似蛋白(Srw1-likep

10、rotein,GenBank登錄號(hào)為CAB44330.1和CAB78235.1)在氨基酸水平上具有31%的一致性,46%的相似性。②Clone-SA5基因序列與多種植物的α-微管蛋白(alpha-tubulin)基因家族中的有些基因的部分序列具有很高的相似性,其基因片段中的96-390核苷酸編碼98個(gè)氨基酸,包含起始密碼子ATG,但沒有發(fā)現(xiàn)終止子密碼子。③Clone-SG6基因序列與多種植物的質(zhì)膜H+-ATPase酶基因家族中的有些基因

11、的部分序列具有很高的相似性,其基因片段中的4-408核苷酸編碼136個(gè)氨基酸,包含起始密碼子ATG,沒有發(fā)現(xiàn)終止子密碼子。④Clone-CC7基因序列未檢索到有同源性。
　　6.克隆片段的氨基酸序列分析及功能預(yù)測(cè):①多序列比對(duì)分析顯示,鐵皮石斛Clone-SA5基因和Clone-SG6基因在進(jìn)化上都非常保守,與很多物種有高度的相似性。②鐵皮石斛Clone-SA8序列與L.corniculatusvar.japonicusCCS52

12、A和擬南芥Srw1-like分別進(jìn)行的雙重對(duì)比顯示,它們的相似度不是很強(qiáng),局部形似性較高,但中間都有斷裂。Clone-SA8蛋白含有14個(gè)可能的結(jié)構(gòu)區(qū)域或功能區(qū)域,分屬5個(gè)功能類型,分子量為18.932KD,理論等電點(diǎn)pI為9.67,化學(xué)方程式為C810H1313N253O265S3,半衰期為30hours,不穩(wěn)定指數(shù)68.49,脂肪族指數(shù)62.90,總平均疏水性-1.070,表明Clone-SA8蛋白為親水蛋白;其二級(jí)結(jié)構(gòu)是混合型的,

13、主要由α-螺旋和環(huán)狀或轉(zhuǎn)角組成;沒有發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽,說明該蛋白不是分泌型蛋白;沒有發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)域存在;沒有預(yù)測(cè)出合適的卷曲螺旋;有6個(gè)超過閾值的糖基化位點(diǎn)。最后,對(duì)應(yīng)力與植物生長代謝和基因表達(dá)問題進(jìn)行了初步的探討。聲波作為一種交變應(yīng)力,對(duì)植物生長代謝和基因表達(dá)有顯著的影響。
　　本實(shí)驗(yàn)所選擇的聲波模式是一種對(duì)鐵皮石斛生長代謝起促進(jìn)作用的應(yīng)力模式;通過剪切力、聲流現(xiàn)象、能量轉(zhuǎn)換等物理學(xué)效應(yīng)增強(qiáng)細(xì)胞膜的通透性,加速物質(zhì)的流動(dòng),改變相關(guān)酶的活