EC-SOD基因的克隆和表達(dá)研究.pdf

1、本文根據(jù)人類EC-SODcDNA文庫(GenBank登錄號(hào)為NM003102)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，提取人血紅細(xì)胞RNA，通過RT-PCR的方法克隆EC-SOD基因的編碼區(qū)片段。該編碼區(qū)長度為465bp，編碼由155個(gè)氨基酸組成的，分子質(zhì)量為16KDa的蛋白。 隨后，通過在EC-SOD基因片段兩端添加HindⅢ、BamHlI酶切位點(diǎn)，將其克隆至原核表達(dá)質(zhì)粒pQE30，構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30-EC-SOD，轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15，經(jīng)

2、IPTG誘導(dǎo)得到高效表達(dá)，并通過Ni-NTASpinKit對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化，得到大小約為16KDa的蛋白;EC-SOD原核透析復(fù)性48hr，用焦酚自氧化法對(duì)復(fù)性前后的蛋白進(jìn)行酶活測(cè)定，表明復(fù)性后的酶活提高了約1.2倍，效果較好。 此外，在EC-SOD基因片段兩端添加HindⅢ，XbaI酶切位點(diǎn)，將其克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pYES2/CT，構(gòu)建重組質(zhì)粒pYES-EC-SOD，轉(zhuǎn)化釀酒酵母W303-1a，經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)，通過SDS-P