龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中SOD基因家族的克隆及表達(dá)調(diào)控研究.pdf

1、龍眼(Dimocarpus longan Lour.)是我國(guó)南方重要的熱帶亞熱帶木本果樹(shù)，其胚胎發(fā)育狀況與其果實(shí)的產(chǎn)量及品質(zhì)密切相關(guān)。植物胚胎的發(fā)育是一個(gè)細(xì)胞分化的過(guò)程，該過(guò)程中必然有氧化脅迫的影響，而超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)作為抗氧化系統(tǒng)的第一道防線在植物胚胎的細(xì)胞分化和發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。本研究利用龍眼體胚發(fā)生模式實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，在進(jìn)行龍眼體胚發(fā)生過(guò)程SOD的生理生化研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行S

2、OD基因家族克隆及表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究(啟動(dòng)子分離與功能鑒定、miRNA分離與鑒定以及相關(guān)基因和miRNA定量表達(dá)分析等)，以探討在龍眼體胚發(fā)生中SOD的作用的分子機(jī)制，并為龍眼活體胚胎發(fā)育中的SOD作用機(jī)制提供參考。主要結(jié)果如下：
　　 1.龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中SOD酶活性變化及同工酶分析
　　 在本研究中首先對(duì)龍眼活體晚期胚胎和早期離體胚胎中的SOD活性及同工酶譜進(jìn)行了初步分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不管是龍眼晚期活體胚胎或早期離體胚

3、胎，隨著龍眼胚胎的進(jìn)一步發(fā)育，SOD的活性均呈逐漸升高趨勢(shì)，說(shuō)明SOD對(duì)胚性細(xì)胞的分化以及晚期胚胎發(fā)育具有促進(jìn)作用。溫度處理對(duì)龍眼體胚發(fā)生早期SOD活性影響較小，而對(duì)SOD同工酶譜影響較大，表現(xiàn)為譜帶的出現(xiàn)與消失，其中25℃處理的龍眼胚性培養(yǎng)物，SOD同工酶譜條帶數(shù)最多，而20℃和30℃處理的材料，表達(dá)較弱的酶譜條帶消失。提示SOD活性與同工酶譜的規(guī)律變化與龍眼體胚發(fā)生早期細(xì)胞分化、超氧自由基的清除以及促使體胚正常發(fā)育有密切關(guān)系。

4、>　　 2.龍眼胚性愈傷組織SOD基因家族cDNA和DNA全長(zhǎng)的獲得
　　 在酶活性測(cè)定的基礎(chǔ)上，利用RT-PCR和RACE法從龍眼胚性愈傷組織中獲得SOD基因家族20個(gè)不同mRNA轉(zhuǎn)錄本，它們分別編碼細(xì)胞質(zhì)D1CSD1a和D1CSD1b、葉綠體D1CSD2a、葉綠體D1FSD1a、D1FSD1b及線粒體D1MSD等，這是木本植物SOD首次克隆較為完整的，也是植物體胚SOD基因分離較為完整的；SOD基因家族各成員的3’UTR序

5、列的長(zhǎng)度都具有多態(tài)性，可能與miRNA的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控相關(guān)；此外，還獲得了DlCSD1a-4、DlCSD1a-5、DlCSD1b-variant1和DlFSD1b-vaxiant1～DlFSD1b-variant4等7個(gè)不同的可變剪接體，它們發(fā)生剪接的位置不盡相同，并存在各自不同的剪接模式。DlCSD1a基因基因組序列長(zhǎng)2741 bp，含8個(gè)內(nèi)含子；DlCSD1b基因長(zhǎng)4592 bp，含6個(gè)內(nèi)含子；DlCSD2a基因長(zhǎng)3727 bp，含

6、7個(gè)內(nèi)含子；DlFSD1a基因長(zhǎng)2171 bp，含6個(gè)內(nèi)含子；DlFSD1b基因長(zhǎng)2137
　　 bp，含7個(gè)內(nèi)含子；DlMSD基因長(zhǎng)1589 bp，含5個(gè)內(nèi)含子；所有內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)均符真核生物GT-AG規(guī)則。不同基因所含內(nèi)含子和外顯子的長(zhǎng)度不一，其中DlCSD1b的第5個(gè)內(nèi)含子、DlCSD2a的第6個(gè)內(nèi)含子的長(zhǎng)度較長(zhǎng)，分別為3539 bp和2178 bp，長(zhǎng)內(nèi)含子的存在可能有利于產(chǎn)生多種mRNA分子，編碼出多種功能的蛋白質(zhì)。

7、
　　 3.龍眼胚性愈傷組織SOD基因家族生物信息學(xué)分析
　　 根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，龍眼胚性愈傷組織DlSODs編碼的蛋白質(zhì)不同成員均含有SOD典型的保守結(jié)構(gòu)域，屬于超氧化物歧化酶大家族的不同成員，它們?cè)谶M(jìn)化上具有高度保守性，在功能上也具有較大相似性，均為親水的酸性蛋白，除D1FSD1a和D1FSD1b外，其余均為穩(wěn)定蛋白。不過(guò)不同類型的SOD又具有各自特點(diǎn)，它們?cè)邶堁垠w胚中的可能作用機(jī)理：①D1CSD1a和D1CS

8、D1b定位于細(xì)胞質(zhì)，不含信號(hào)肽，不進(jìn)行跨膜運(yùn)動(dòng)，兩者相互協(xié)調(diào)主要負(fù)責(zé)細(xì)胞質(zhì)中活性氧等的清除，并以絲氨酸為主和蘇氨酸的位點(diǎn)為輔發(fā)生磷酸化；②D1CSD2a定位于葉綠體，含有信號(hào)肽，以由葉綠體內(nèi)膜到葉綠體外膜上方式進(jìn)行跨膜運(yùn)動(dòng)，主要負(fù)責(zé)葉綠體細(xì)胞中活性氧等的清除，并以絲氨酸為主和蘇氨酸為輔的位點(diǎn)發(fā)生磷酸化；③D1FSD1a定位于葉綠體，含有信號(hào)肽，不含跨膜結(jié)構(gòu)域，可能與D1CSD2a協(xié)同作用負(fù)責(zé)葉綠體細(xì)胞中活性氧等的清除，并以絲氨酸為主、蘇

9、氨酸及酪氨酸為輔的位點(diǎn)發(fā)生磷酸化；④D1FSD1b和D1FSD1b(JF316733)可能定位于過(guò)氧化物酶體和細(xì)胞質(zhì)，均不含信號(hào)肽，含2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，傾向于由外到內(nèi)進(jìn)行跨膜運(yùn)動(dòng)，并以酪氨酸為主、絲氨酸及蘇氨酸為輔的位點(diǎn)發(fā)生磷酸化；⑤D1MSD定位于線粒體，不含信號(hào)肽，存在從線粒體內(nèi)膜到外膜或從外膜到內(nèi)膜的雙向跨膜運(yùn)動(dòng)的2個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域，主要負(fù)責(zé)線粒體細(xì)胞中活性氧等的清除，并以絲氨酸為主、蘇氨酸及酪氨酸為輔的位點(diǎn)發(fā)生磷酸化。
　　

10、 4.龍眼胚性愈傷組織SOD基因家族啟動(dòng)子克隆和功能鑒定
　　 為進(jìn)一步了解SOD基因家族在轉(zhuǎn)錄水平上的調(diào)控作用，本研究采用Tail-PCR法和IPCR法，分別獲得了DlCSD1a、DlCSD2a、DlFSD1a和DlMSD基因啟動(dòng)子序列，長(zhǎng)度分別為2252bp、164 bp、1080 bp和843 bp，其中，DlCSD1a啟動(dòng)子區(qū)域含有2個(gè)內(nèi)含子序列。利用RLM-RACE法鑒定DlSODs基因家族的TSS，結(jié)果顯示它們都含

11、有豐富的TSS，數(shù)量從3～10個(gè)不等；5'UTR長(zhǎng)度波動(dòng)范圍較大，介于11～193 bp之間；TSS堿基組成一般以A為主，其次為G和C，還少數(shù)出現(xiàn)T。龍眼DlSOD基因家族不同成員存在多個(gè)TSS且各TSS起始mRNA轉(zhuǎn)錄效率不同，暗示RNA聚合酶和調(diào)控因子在DlSOD基因家族啟動(dòng)子的一個(gè)較寬范圍內(nèi)的互作控制了轉(zhuǎn)錄的效率。PlantCare軟件分析顯示，DlCSD1a、DlCSD2a和DlFSD1a基因啟動(dòng)子區(qū)域中，均含有核心啟動(dòng)子元件和

12、基本啟動(dòng)子區(qū)，但DlMSD基因5'端基礎(chǔ)啟動(dòng)區(qū)缺少TATA和CAAT盒；此外，還存在大量與光響應(yīng)、激素應(yīng)答、環(huán)境脅迫響應(yīng)、胚乳特異表達(dá)響應(yīng)、細(xì)胞周期相關(guān)響應(yīng)及大量的功能未知或功能特異的相關(guān)元件；另外不同成員SOD基因還存在各自功能特異的順式元件。此外，DlCSD1a和DlFSD1a基因可能受bZIP類轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，而DlMSD可能受WRKY類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。在此基礎(chǔ)上，還構(gòu)建它們3’/5'不同缺失突變體的瞬時(shí)表達(dá)載體，為將來(lái)功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

13、奠定基礎(chǔ)。
　　 5.龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中調(diào)控SOD基因家族的小分子RNA的分離與鑒定
　　 為了解DlSODs基因在轉(zhuǎn)錄后水平上的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，本研究首先采用Solexa技術(shù)對(duì)龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的sRNA進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果表明：共得到Unique序列6，553，782條，其中僅13，151條序列與已知miRNAs相似；sRNA以24 nt的長(zhǎng)度為主要存在方式；龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中miRNA的表達(dá)豐度存在巨大差異，其中大部分為低

14、豐度表達(dá)；總共鑒定了367個(gè)保守miRNA，構(gòu)成眾多家族，不同家族間成員數(shù)量存在巨大差異；另外獲得23個(gè)候選的新miRNA，其中有10個(gè)miRNA含單個(gè)基因座，另13個(gè)miRNA具備多個(gè)基因座。在上述基礎(chǔ)上，結(jié)合psRNA Target預(yù)測(cè)軟件和RLM-RACE法最終鑒定到調(diào)控DlSODs的11個(gè)dlo-miRNAs，它們以裂解DlSODs mRNA的方式調(diào)控其在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的轉(zhuǎn)錄后水平表達(dá)。這11個(gè)dlo-miRNAs分別是dl

15、o-miR156(靶標(biāo)DlCSD1 a)；dlo-miR159、863-3p、1023b-3p、1223和2643(靶標(biāo)DlCSD1b)；dlo-miR159、398、1171a和1171b(靶標(biāo)DlCSD2a)以及dlo-miR808和2089(靶標(biāo)DlFSD1a)，它們?cè)邶堁垠w胚發(fā)生過(guò)程中呈較大差異表達(dá)，推測(cè)其差異表達(dá)導(dǎo)致了不同類型SOD基因在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中表達(dá)模式的不同。此外利用RT-PCR法克隆獲得pre-miR398a/b

16、序列，它們與其它植物的前體序列具有高度保守性。
　　 6.龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中SOD基因家族及miRNA定量表達(dá)分析
　　 ①龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中SOD基因家族表達(dá)模式分析
　　 在上述研究的基礎(chǔ)上，以及對(duì)龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中qPCR內(nèi)參基因篩選的基礎(chǔ)上，對(duì)不同類型DlSODs的表達(dá)模式進(jìn)行分析。首先，不同類型DlSODs在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)變化趨勢(shì)比較接近，它們主要在體胚發(fā)育的中期和成熟胚中起作用。從松散型胚性

17、愈傷組織開(kāi)始到成熟胚等9個(gè)階段，它們總體的表達(dá)變化趨勢(shì)主要體現(xiàn)為“遞增(胚性愈傷Ⅱ)-遞減(不完全胚性緊實(shí)結(jié)構(gòu))-遞減(緊實(shí)胚性球形結(jié)構(gòu))-遞減(球形胚)-遞增(心形胚)-遞減(魚(yú)雷形胚)-遞減(子葉形胚)-遞增(成熟胚)”模式。其次，不同類型SODs在龍眼體胚不同發(fā)育階段有明顯的分工。在胚性愈傷組織Ⅱ和心形胚階段，所有類型SOD都介導(dǎo)了其發(fā)育；球形胚階段的形態(tài)建成則主要由DlCSD1a-5租DlCSD1b-2負(fù)責(zé)；魚(yú)雷形胚階段的發(fā)育主

18、要受DlFSD1a、DlFSD1b租DlMSD的調(diào)控；在子葉形胚階段，所有類型SODs的轉(zhuǎn)錄水平均很低；在成熟胚階段的形態(tài)建成則主要以DlCSD1a為主，DlMSD為輔負(fù)責(zé)。此外，還研究了DlSODs基因家族與其它抗氧化系統(tǒng)的相關(guān)基因CAT和POD和分子伴侶DlCCS之間表達(dá)模式的相互關(guān)系，表明CAT、POD等抗氧化系統(tǒng)相關(guān)基因與DlSODs的相互協(xié)調(diào)表達(dá)，從而保證了ROS網(wǎng)絡(luò)的正常運(yùn)行；DlCCS的正常穩(wěn)定表達(dá)對(duì)維持DlCSDs正常發(fā)

19、揮生物學(xué)功能是必須的，但DlCSDs的激活也并不完全依賴于DlCCS的存在。
　　 ②龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中miRNAs表達(dá)模式分析
　　 在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中qPCR miRNA內(nèi)參基因篩選的基礎(chǔ)上，對(duì)20個(gè)dlo-miRNAs的表達(dá)模式進(jìn)行分析。dlo-miR3，5，10，12，13，156a，156c，397a，398b.1，398b.2，398b.3，808和2089*等miRNA共同介導(dǎo)了龍眼體胚發(fā)生早期的形態(tài)建成

20、，它們均在體胚發(fā)生早期球形胚之前大量表達(dá)，晚期表達(dá)量多數(shù)下降，部分miRNA甚至不表達(dá)；dlo-miR6、160a和167a可能在龍眼體胚發(fā)生的中晚期起主要作用。dlo-miR6、160a轉(zhuǎn)錄水平的累積對(duì)龍眼心形胚和魚(yú)雷形胚的形態(tài)建成可能是必須的；dlo-miR167a在龍眼子葉胚和成熟胚中起主要作用；而dlo-miR159a.1、159a.2、159c和159f在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中的表達(dá)均比較穩(wěn)定。以上說(shuō)明miRNAs表達(dá)的組織和時(shí)空

21、特異性共同介導(dǎo)了龍眼體胚的發(fā)生。
　　 ③龍眼體胚的發(fā)生過(guò)程miRNA與DlSODs表達(dá)模式的比較分析
　　 miRNA-DlSODs的協(xié)調(diào)表達(dá)參與調(diào)控了龍眼體胚的發(fā)生。對(duì)miRNA與D1SODs表達(dá)模式進(jìn)行比較分析表明：dlo-miR156家族、159家族、398b家族、808和2089*在龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中均有特異性擴(kuò)增，且表達(dá)量能與相應(yīng)靶基因呈負(fù)相關(guān)；然而dlo-miR863-3p、1023b-23p、1171a/

22、b、1223和2643卻未能得到特異性擴(kuò)增但卻能鑒定到它們裂解的mRNA片段，提示在龍眼體胚中可能還存在其它潛在的miRNA或內(nèi)源siRNA介導(dǎo)了DlSODs的表達(dá)。此外，不同miRNA成員間在不同發(fā)育階段具有明確的分工，甚至不同miRNA成員可能控制著相應(yīng)mRNA轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)，如dlo-miR159家族的4個(gè)成員分別調(diào)控著DlCSD1b、DlCSD2a不同發(fā)育階段的表達(dá)。在龍眼體胚發(fā)生早期(球形胚前)，它們的表達(dá)主要由dlo-miR1

23、59a.1負(fù)責(zé)；從球形胚到心形胚則由dlo-miR159c和159f負(fù)責(zé)；心形胚到成熟胚階段由dlo-miR159a.2和dlo-miR159c負(fù)責(zé)，這種現(xiàn)象還在dlo-miR156家族及398b家族出現(xiàn)。這可能提示當(dāng)miRNA某個(gè)成員不能裂解mRNA表達(dá)時(shí)，另外一些成員則對(duì)其功能進(jìn)行互補(bǔ)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。dlo-miR159同時(shí)介導(dǎo)DlCSD1b租DlCSD2a的表達(dá)，并負(fù)責(zé)協(xié)調(diào)不同靶基因間的表達(dá)變化趨勢(shì)；miRNA

24、可能以裂解靶基因mRNA的降解或抑制靶蛋白質(zhì)翻譯兩種調(diào)控機(jī)制并存的方式同時(shí)介導(dǎo)靶基因的表達(dá)。此外，dlo-miR398b與pre-miR398b的表達(dá)模式基本一致，它們與靶基因DlCSD2a的表達(dá)模式剛好相反，說(shuō)明前體miRNA能在一定程度上反應(yīng)成熟miRNA的表達(dá)情況。
　　 綜上所述，龍眼體胚發(fā)生過(guò)程中DlSODs的表達(dá)調(diào)控機(jī)制可能是：當(dāng)外界環(huán)境因子發(fā)生改變時(shí)(內(nèi)源激素或外界環(huán)境因子脅迫)，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平發(fā)生變化，進(jìn)而啟動(dòng)