miPEPs在龍眼體胚發(fā)生過程中的應(yīng)用研究.pdf

1、龍眼（Dimocarpus longan Lour.），是我國南亞熱帶地區(qū)名貴果樹。龍眼果核大小、坐果率、果實品質(zhì)及產(chǎn)量等決定于其胚胎發(fā)育狀況的優(yōu)良與否。龍眼體細胞胚胎發(fā)生系統(tǒng)可作為其重要的替代模式系統(tǒng)解決龍眼早期胚胎在遺傳上的高度雜合問題。目前在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上，由mRNA編碼的植物多肽作為一種新型肥料，能明顯增加產(chǎn)量并提高品質(zhì)。已有研究表明由pri-miRNA編碼的miPEP對植物相關(guān)miRNA的表達和形態(tài)建成等方面均有較大影響。目前龍眼

2、中尚未有研究，本試驗以龍眼體胚發(fā)生系統(tǒng)為基礎(chǔ)，主要研究結(jié)果如下：
　　1.龍眼pri-miRNA全長序列的獲得及生物信息學(xué)分析。利用RLM-RACE技術(shù)，對16個miRNA使用GeneRACE反轉(zhuǎn)錄試劑盒，分別獲得3，UTR8條和5，UTR10條，使用SMART?RACE試劑盒分別獲得3，UTR3條和5，UTR5條；克隆獲得pri-miRNA全長序列10條。通過對18個pri-miRNA確定轉(zhuǎn)錄起始位點，發(fā)現(xiàn)它們均含有不少于1個轉(zhuǎn)

3、錄起始位點，轉(zhuǎn)錄起始位點數(shù)量存在差異。對18個pri-miRNA的啟動子分析，發(fā)現(xiàn)它們均含有激素響應(yīng)順式作用元件，且均含有赤霉素和茉莉酸甲酯順式作用元件但種類和元件個數(shù)存在差異。
　　2.龍眼19個pre-miRNA的表達模式分析。19個pre-miRNA在龍眼EC、IcpEC、CpECGE和GE4個不同發(fā)育階段表達模式分析發(fā)現(xiàn)：除pre-miR156-scaffold29和pre-miR156e*-scaffold3未檢測到表達

4、外，有表達的17個pre-miRNA在 IcpEC和 CpECGE表達均不高。在龍眼 EC階段中， pre-miR168a-scaffold2621、 pre-miR2118a-scaffold26、 pre-miR170-scaffold1266和pre-miR396a-scaffold38相對表達量較高。發(fā)育至IcpEC階段，17個pre-miRNA的相對表達量均不高；發(fā)育至CpECGE時，除pre-miR395a-scaffold

5、6相對表達量略高些，其他16個pre-miRNA表達量較低。發(fā)育至 GE階段， pre-miR160a-scaffold209、pre-miR390a-scaffold24、 pre-miR319a-scaffold517和 pre-miR482a-scaffold26表現(xiàn)出較高的表達量。比較19個pre-miRNA在‘紅核子’龍眼不同器官的表達模式，發(fā)現(xiàn)19個 pre-miRNA除 pre-miR156-scaffold29、pre-

6、miR156e*-scaffold38和 pre-miR398b-scaffold58未檢測出外，有表達的pre-miRNA多數(shù)多花的生長發(fā)育具有較大的調(diào)控作用，在其他器官中不同pre-miRNA存在差異。對18個pri-miRNA啟動子中均有激素順式作用元件，有響應(yīng)的各pre-miRNA效果存在差異。分別用0.5 mg/L2,4-D、2.0 mg/L赤霉素、1.0 mg/L吲哚乙酸、25μmol/L水楊酸、10μmol/L脫落酸和25

7、μmol/L茉莉酸甲酯對龍眼愈傷組織處理24 h后發(fā)現(xiàn)：pre-miR319-scaffold517在生長素2,4-D、吲哚乙酸和赤霉素處理下，其相對表達量均有明顯促進作用。pre-miR168a-scaffold2621在生長素2,4-D和吲哚乙酸處理中表達量具明顯促進作用。生長素2,4-D處理對pre-miR482a-scaffold26則表現(xiàn)出明顯的抑制效果。吲哚乙酸處理下，對 pre-miR168a-scaffold2621、p

8、re-miR170-scaffold1266和 pre-miR319-scaffold517的表達有促進效果。在水楊酸處理下， pre-miR398b-scaffold58表達量受抑制。在赤霉素處理下，對pre-miR160-scaffold209和pre-miR171f-scaffold537的表達具有極顯著的抑制表達效果，而對 pre-miR319-scaffold517、pre-miR394a-scaffold3884、pre-m

9、iR395a-scaffold6和pre-miR396a-scaffold38則促進效果極明顯。在茉莉酸甲酯處理中，pre-miR395a-scaffold6的表達抑制效果明顯。
　　3.miPEP在龍眼體胚發(fā)生過程中的研究。采用15μmol/L由 pri-miR319不同轉(zhuǎn)錄起始位點編碼的miPEP319-1、miPEP319-2和miPEP319-3連續(xù)處理龍眼愈傷組織處理3 d，結(jié)果顯示： miPEP319-2對龍眼miR3

10、19家族的3個成員表達量均有明顯的抑制效果，miPEP319-1和miPEP319-3影響較小。探究不同濃度miPEP319-2對龍眼體胚中miR319家族成員表達影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.4μmol/L miPEP319-2對miR319家族成員表達均有促進作用，且對miR319c促進效果最明顯。探究處理時間對miR319家族成員表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在24 h內(nèi)，不同時間對miR319家族中成員表達量有促進效果，但促進效果較緩慢。探究不同氨

11、基酸序列對miR319家族表達影響，發(fā)現(xiàn)0.4μmol/L miPEP319-2和miPEP319-2這兩種均能促進miR319家族的不同成員的表達，但促進的程度存在差異。
　　4.miPEP319在龍眼體胚發(fā)生中的應(yīng)用研究。選取具有多個轉(zhuǎn)錄起始位點且對植物的形態(tài)建成以及抗逆性均有較大的影響的miR319，探究pri-miR319編碼的miPEP319對龍眼懸浮培養(yǎng)周期內(nèi)的應(yīng)用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在龍眼體胚發(fā)生早期，miPEP319-2和

12、scrambled miPEP319-2處理對miR319c的作用效果更明顯，同時抑制龍眼 pre-miR319a-scaffold517、 pre-miR319a-scaffold1667和pre-miR319a-scaffold1709的表達。miPEP319-2對Dlo_022819_TCP4和 Dlo_025379-GMMY的表達具有抑制表達的效果，而對Dlo_020213_TCP4、Dlo_026743_TCP4和 Dlo_0

13、21198.2-GMMYB3個靶標的表達卻能促進表達。scrambled miPEP319-2除對Dlo_020213_TCP4有促進效果外，對其他4個靶標的表達均為抑制作用。形態(tài)上發(fā)現(xiàn)用scrambled miPEP319-2和miPEP319-2處理，龍眼細胞團顆粒變大，且顏色變深，顯微觀察發(fā)現(xiàn)細胞排列更緊密，細胞大小不均勻。
　　龍眼pri-miR319不同轉(zhuǎn)錄起始位點編碼的miPEP對龍眼體胚發(fā)生的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：miPE

14、P319-2和miPEP319-3對龍眼miR319家族成員、pre-miR319以及靶標作用效果相似，miPEP319-1與這二者之間作用效果存在差異：miPEP319-1促進miR319家族3個成員的表達；抑制 pre-miR319a-scaffold213、 pre-miR319a-scaffold517、pre-miR319a-scaffold1667和pre-miR319a-scaffold1709的表達；促進靶標Dlo_02