金花茶體胚發(fā)生過(guò)程中PPO基因的克隆及其表達(dá).pdf

1、金花茶(Camellia nitidissima Chi.)屬于山茶科(Theaceae)山茶屬，灌木狀多年生木本植物，以蠟質(zhì)的黃色花朵而聞名，是稀有的園林觀花植物。除觀賞價(jià)值外，金花茶在人們生活中，尤其是食品、藥用、保健品等工業(yè)中有著重要的作用，但其自然繁殖率低，而采用組織培養(yǎng)技術(shù)可以加速繁殖速度，且有利于種質(zhì)保存以及其他的方面研究。本試驗(yàn)以金花茶成年材料離體再生體系為材料來(lái)源，獲得同步化體胚材料，克隆了金花茶體胚PPO基因，采用實(shí)時(shí)

2、熒光定量PCR技術(shù)對(duì)金花茶體胚發(fā)生過(guò)程中PPO基因表達(dá)變化進(jìn)行了研究，并測(cè)定了金花茶體胚發(fā)生過(guò)程中PPO酶活性的變化。此外，對(duì)金花茶體胚發(fā)生過(guò)程中POD、APX進(jìn)行活性和同工酶變化進(jìn)行了分析。主要研究結(jié)果如下： 1.金花茶同步化體胚材料獲得 以金花茶體胚為材料，進(jìn)行同步化體胚篩選。結(jié)果表明：在添加山梨醇的MS培養(yǎng)基上，體胚生長(zhǎng)色澤形態(tài)良好，球形胚和子葉胚能夠獲得同步化材料，心形胚和成熟胚則采用培養(yǎng)和挑選手段結(jié)合獲得同步化

3、材料，離體苗和花狀子葉胚在培養(yǎng)基上能夠保持良好的生長(zhǎng)狀況。分別以金花茶子葉胚切塊和成年植株葉片為材料，進(jìn)行愈傷組織培養(yǎng)的研究。結(jié)果表明：金花茶子葉胚去外表皮后切塊，接種于MS+1.5 mg·L-12，4-D+0.5mg·L-1KT能誘導(dǎo)出愈傷組織，并能較好的繼代，蔗糖濃度為6％時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)良好。金花茶成年葉片以流水中沖洗30min，75％的酒精浸泡30s后，轉(zhuǎn)入0.2％HgCl2消毒劑浸泡8min方法消毒后，接種于MS+1.5 mg

4、·L-16-BA+0.5 mg·L-1IAA+4 mg·L-1 NAA，愈傷誘導(dǎo)率為98.335％，遮光有助于葉片愈傷組織的生長(zhǎng)。 2金花茶體胚PPO基因克隆 以金花茶球形胚為材料，在已知得山茶屬植物PPO基因序列上設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行巢式PCR，經(jīng)過(guò)引物篩選得到1800bp左右的特異條帶。該目的片段經(jīng)測(cè)序得到的長(zhǎng)為1788bp，該序列與登錄Genbank山茶屬其他植物PPO基因序列進(jìn)行核苷酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)，同源性74％左右；經(jīng)分析

5、后發(fā)現(xiàn)金花茶體胚PPO基因編碼595個(gè)氨基酸，與登錄Genbank山茶屬其他植物PPO基因序列進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，同源性為72％左右。 3.金花茶體胚發(fā)生過(guò)程中PPO基因?qū)崟r(shí)熒光定量表達(dá)分析 本研究以18S rRNA作為內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了金花茶體胚發(fā)生過(guò)程中PPO基因表達(dá)變化。結(jié)果表明：金花茶體胚發(fā)生過(guò)程中PPO基因表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，球形胚PPO基因表達(dá)量最大；子葉胚和心形胚次之，成熟胚最?。欢?/p>

6、常子葉胚和花狀多子葉胚的表達(dá)量存在明顯差異。 4.金花茶體胚發(fā)生過(guò)程中PPO活性變化分析 對(duì)金花茶體胚發(fā)生過(guò)程中PPO活性變化規(guī)律進(jìn)行研究。結(jié)果表明：在金花茶體胚發(fā)育過(guò)程PPO活性明顯比較低，變化趨勢(shì)與PPO基因定量表達(dá)結(jié)果相似。 5.金花茶體胚發(fā)生過(guò)程中相關(guān)酶變化研究 對(duì)金花茶體胚發(fā)生過(guò)程中各個(gè)階段的培養(yǎng)物相關(guān)酶活性變化規(guī)律進(jìn)行研究。結(jié)果表明：在金花茶體胚發(fā)育過(guò)程中POD酶活性呈先升高后下降趨勢(shì)；APX