BMP1基因在動物卵泡發(fā)生過程中的表達(dá)模式及功能的初步研究.pdf

1、動物卵泡發(fā)生調(diào)控的分子機(jī)制是發(fā)育生物學(xué)研究的熱點(diǎn)問題。有研究表明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)家族廣泛參與動物卵泡發(fā)生調(diào)控的過程，其中BMP1基因與TGF-β家族的BMP2-7基因不同，BMP1是具有獨(dú)特蛋白結(jié)構(gòu)域的金屬蛋白酶，屬于蝦紅素家族。最新報(bào)道顯示，BMP1基因在綿羊卵泡發(fā)生過程中亦有表達(dá)，但其在動物卵泡發(fā)生中的表達(dá)模式和功能仍待深入探索。本研究以單胎大家畜水牛、多胎家畜豬和多胎試驗(yàn)動物小鼠為模型，系統(tǒng)研究BMP1基因在卵泡發(fā)生各

2、時(shí)期和早期胚胎發(fā)育時(shí)期表達(dá)模式，并通過卵泡顆粒細(xì)胞、體外成熟卵母細(xì)胞和活體卵巢試驗(yàn)，探討其發(fā)揮調(diào)控卵泡發(fā)育的分子機(jī)制。取得如下結(jié)果:
　　1.水牛BMP1基因克隆與生物信息分析
　　以GenBank數(shù)據(jù)庫中牛的BMP1（XM002689771.1）為參考序列設(shè)計(jì)合成特異性擴(kuò)增引物，以水牛卵巢組織總RNA為模板，應(yīng)用RT-PCR成功擴(kuò)增獲得編碼水牛BMP1基因cDNA序列。測序結(jié)果表明:水牛BMP1基因的cDNA序列長3195

3、 bp，包含完整的2967 bp的開放讀碼框，編碼989個(gè)氨基酸，蛋白分子量為111.5 kDa，等電點(diǎn)為7.08。序列相似性分析結(jié)果顯示水牛BMP1基因與牛、綿羊、豬、人和小鼠BMP1基因的核苷酸序列相似性分別為99％、98％、93％、91％和89％，氨基酸相似性分別為99％、97％、96％、95％和95％，進(jìn)一步構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹表明BMP1基因在動物進(jìn)化過程中具有高度的保守特性。蛋白結(jié)構(gòu)域分析顯示水牛BMP1基因具有顯著的HELGHV

4、IGFWHE鋅離子結(jié)合域和保守的Met-turn SIMHY區(qū)，含有一個(gè)前蛋白區(qū)，一個(gè)鋅離子結(jié)合區(qū)、五個(gè)CMB和兩個(gè)EGF-Like功能區(qū)，與其他物種BMP1基因的結(jié)構(gòu)域相同或相似，成功克隆了一種水牛物種的新型金屬蛋白酶。
　　2.BMP1基因在水牛卵泡發(fā)生過程中的表達(dá)模式研究
　　首先通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR(QRT-PCR)和Western Blotting分析了BMP1基因在水牛不同組織器官中的表達(dá)模式及規(guī)律。結(jié)果顯示，

5、BMP1基因在水牛胎兒時(shí)期不同組織中都有表達(dá)且差異顯著(P＜0.05)，其中在心臟中表達(dá)最高，卵巢和睪丸次之。此外，WesternBlotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMP1基因以不同剪切體的形式存在于水牛不同的組織當(dāng)中。分離不同直徑的水牛卵泡，QRT-PCR檢測結(jié)果顯示，BMP1基因在卵泡中的表達(dá)呈現(xiàn)隨著卵泡直徑的增大而逐漸升高的趨勢，在3～4.5 mm直徑卵泡中表達(dá)量最高，且不同直徑卵泡間BMP1基因的表達(dá)差異顯著(P＜0.05)。免疫組化分

6、析結(jié)果顯示，BMP1基因從水牛胎兒時(shí)期的卵巢，以及到性成熟之后的水牛的卵巢中的不同發(fā)育時(shí)期的卵泡中都有不同程度的表達(dá)，并主要表達(dá)于卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中。免疫熒光檢測結(jié)果顯示，BMP1基因特異性的定位于顆粒細(xì)胞中和卵母細(xì)胞的膜上。QRT-PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMP1基因在水牛成熟后COCs（卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體）和卵母細(xì)胞中表達(dá)量高于成熟前，且BMP1基因在COCs中的表達(dá)顯著高于裸卵(P＜0.05)。
　　3.BMP1基因調(diào)控體外培

7、養(yǎng)水牛顆粒細(xì)胞生長和卵泡發(fā)生的機(jī)制研究
　　在水牛顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中添加不同濃度的BMP1重組蛋白和BMP1抗體，以研究BMP1基因?qū)︻w粒細(xì)胞增殖以及相關(guān)因子表達(dá)變化的影響。結(jié)果顯示:BMP1基因在體外培養(yǎng)水牛顆粒細(xì)胞中的表達(dá)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而顯著增加(P＜0.05)，在體外培養(yǎng)96 h時(shí)達(dá)到最高。添加BMP1重組蛋白(25 ng/mL)顯著促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖(P＜0.05)，提高顆粒細(xì)胞的S期細(xì)胞比例，并能夠抑制顆粒細(xì)胞的凋亡(

8、P＜0.05)。BMP1重組蛋白(25 ng/mL)還可以顯著上調(diào)TGF-β信號通路中配體BMP2、BMP4、BMP6、BMP15、GDF9和TGF-β1-3等基因，受體如BMPR-ⅠA、BMPR-ⅠB、BMPR-Ⅱ和TGF-βR1-3等基因(P＜0.05)，以及Smad蛋白如Smad2、Smad3、Smad4、Smad5等基因的表達(dá)(P＜0.05)。此外BMP1重組蛋白(25 ng/mL)可以顯著抑制三大細(xì)胞凋亡信號通路如線粒體通路如

9、Cytochrome C、Apafl，死亡受體通路如TNFα、TNFR1、Fas、FasL等，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路如Chop、Bax等促凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，以及抑制Caspase家族Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9和Caspase-12的表達(dá)(P＜0.05)。進(jìn)一步研究表明，BMP1重組蛋白(25 ng/mL)還顯著上調(diào)與卵泡選擇和優(yōu)勢化相關(guān)基因如VEGFR1、VEGFR2、PAPP-A、IGF-Ⅱ、IGF-ⅠR、IGF

10、-ⅡR等基因的表達(dá)(P＜0.05)，而添加BMP1抗體得到了相反的結(jié)果，并且隨著抗體濃度的增加(0～400 ng/mL)，各基因的表達(dá)顯著下調(diào)或者顯著上調(diào)(P＜0.05)，并顯示出劑量依賴效應(yīng)。
　　4.BMP1基因在豬卵泡發(fā)生及早期胚胎發(fā)育中的表達(dá)模式和功能的初步研究
　　首先采用QRT-PCR分析了BMP1基因在豬不同直徑卵泡中的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示，BMP1基因在1～2 mm直徑的卵泡中表達(dá)量最低，在4.5～6.5 mm

11、直徑的卵泡中表達(dá)量最高，并隨著豬卵泡直徑的增大其表達(dá)量逐漸上升，且差異顯著(P＜0.05)。免疫組化分析結(jié)果顯示，BMP1基因在豬不同發(fā)育時(shí)期的卵泡中，從初級卵泡到格拉夫氏卵泡中都存在不同程度的表達(dá)，并主要表達(dá)于卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中。免疫熒光結(jié)果顯示，BMP1基因在豬成熟前后卵母細(xì)胞和卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體中，以及早期孤雌胚胎的發(fā)育過程中都有表達(dá)，并且特異性的表達(dá)于顆粒細(xì)胞膜中。QRT-PCR結(jié)果顯示，BMP1基因在豬成熟后COCs和卵母細(xì)

12、胞中表達(dá)量顯著高于成熟前(P＜0.05)，QRT-PCR和Western Blotting結(jié)果分析得知BMP1基因在豬早期孤雌胚胎中的表達(dá)呈現(xiàn)遞增的趨勢，2細(xì)胞時(shí)期表達(dá)最低，在8細(xì)胞時(shí)期達(dá)到最高，囊胚期顯著下降(P＜0.05)。通過在體外培養(yǎng)的豬卵母細(xì)胞培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的BMP1重組蛋白或者抗體，發(fā)現(xiàn)BMP1重組蛋白(25 ng/mL)可以顯著提高體外卵母細(xì)胞成熟效率，胚胎分裂率，囊胚率和囊胚細(xì)胞數(shù)（P＜0.05）。而抗BMP1

13、抗體添加組(0～400 ng/mL)則顯示了相反的結(jié)果，且結(jié)果呈現(xiàn)一定的劑量依賴效應(yīng)。當(dāng)添加300 ng/mL和400 ng/mL的抗BMP1抗體時(shí)，體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞出現(xiàn)死亡。
　　5.BMP1基因在小鼠卵泡發(fā)生過程中的表達(dá)模式和功能的研究
　　應(yīng)用雌性昆明小鼠作為模式動物，研究BMP1基因在體內(nèi)卵泡發(fā)生中的表達(dá)模式及功能。QRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMP1基因在不同周齡小鼠的卵巢中都有表達(dá)，且差異顯著(P＜0.05)，并于

14、6W小鼠的卵巢中表達(dá)最高。通過免疫組化技術(shù)對BMP1基因在8d、3W、6W、11W和15W小鼠體內(nèi)卵巢進(jìn)行定位研究結(jié)果顯示，BMP1基因在8d、3W、6W、11W和15W小鼠的卵巢中各卵泡發(fā)育階段中均有表達(dá)，并特異性地表達(dá)于顆粒細(xì)胞，在黃體中不表達(dá)。隨后注射BMP1基因特異性抑制劑檢測卵泡發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)變化、卵巢形態(tài)變化、卵巢內(nèi)卵泡發(fā)育形態(tài)，以及卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，小鼠注射BMP1抑制劑后，卵巢內(nèi)卵泡的發(fā)育明顯減少，

15、并停滯在初級卵泡階段。此外，卵巢內(nèi)顆粒細(xì)胞的凋亡顯著增多(P＜0.05)。QRT-PCR結(jié)果顯示，注射BMP1抑制劑后可以顯著抑制卵巢中TGF-β信號通路中配體BMP2、BMP3、BMP4、BMP6、BMP15、GDF9和TGF-β1-3等基因、受體如BMPR-ⅠB、BMPR-Ⅱ和TGF-βR1-3等基因，以及Smad蛋白如Smad2、Smad3、Smad5和Smad8等基因的表達(dá)(P＜0.05)，上調(diào)Follistatin、AMH、S

16、mad6和Smad7的表達(dá)。此外三大細(xì)胞凋亡信號通路如線粒體通路如Cytochrome C、Apafl，死亡受體通路如Fas和FasL等促凋亡相關(guān)基因的表達(dá)出現(xiàn)顯著上調(diào)(P＜0.05)的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。卵巢中與卵泡選擇和優(yōu)勢化相關(guān)基因如IGF-Ⅱ、IGF-ⅠR和IGF-ⅡR等基因的表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05)。
　　結(jié)論:BMP1基因在水牛、豬和小鼠的卵泡發(fā)生過程中均有不同程度的表達(dá)，BMP1基因主要通過調(diào)控顆粒細(xì)胞