種屬特異基因的篩選及功能的初步研究、microRNA-205與CHN1在宮頸癌中的功能研究及HIF1A與VEGF在月經發(fā)生過程中的表達.pdf

1、第一部分種屬特異基因的篩選及功能的初步研究
　　生殖健康，是目前廣泛被關注的問題，生殖疾病已經嚴重危害到我們的生活及后代的健康，并且在全世界范圍內生殖疾病的發(fā)病率在逐年上升。雖然對生殖疾病的遺傳原因及治療措施等方面已有很多研究，但是仍然不足于滿足防治該類疾病的需要。本研究的目的在于通過對人生殖相關的特異基因的研究，為生殖疾病的防治提供分子理論基礎。從進化角度看，靈長類和嚙齒類是同屬靈長總目，但是兩者之間的生殖策略卻截然不同。分別以

2、人和小鼠為高等靈長類和嚙齒類的代表。如，人有血單絨毛膜胎盤、自發(fā)蛻膜化及月經行為;而小鼠是血三絨膜胎盤、沒有自發(fā)蛻膜化及月經行為。生物的性狀是由基因控制的。利用同源基因在不同物種間的進化保守性，選擇同源基因數(shù)據(jù)庫進行研究。首先，從NCBI網站下載同源基因數(shù)據(jù)庫build67，包含人同源基因18915個，小鼠同源基因20747個，利用Excel軟件比較人和小鼠的同源基因并且經過NCBI中 FILTERS工具的篩選，獲得人特異基因248個，

3、小鼠特異基因680個。在UniGene數(shù)據(jù)庫中，調查了人和小鼠特異基因的組織表達特異性，并利用DAVID在線軟件對在子宮和胎盤中有表達的人特異基因進行了初步的功能聚類分析，進一步在the human protein atlas數(shù)據(jù)庫中調查了在女性生系統(tǒng)中各基因的蛋白表達水平，可知BTN3A1、IL-32、ZNF222、ZNF649、ZNF773基因在胎盤中的蛋白表達水平很高，而在別的組織中表達量比較弱或者是沒有檢測到。結合已有相關文獻報

4、道，本研究最后選擇IL-32、ZNF222、LAIR2作為候選基因，進行下一步的研究驗證。用免疫組織化學的方法檢測及結合現(xiàn)有研究資料，可知IL-32、ZNF222及LAIR2在人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞中有高表達，而在人蛻膜及子宮內膜中表達量相對較弱或沒有表達。最后，在人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞系HTR8/SVneo中敲降IL-32的表達后，細胞的增殖、遷移及侵襲能力都顯著被提高;敲降ZNF222的表達后，細胞的遷移和侵襲能力受到明顯的抑制;敲降LAI

5、R2的表達后，細胞的增殖能力被增強了，但是侵襲能力受到明顯的抑制。這些結果表明，IL-32、ZNF222及LAIR2可能在妊娠中發(fā)揮著一定的作用。由此推測，篩選獲得的特異基因在人妊娠過程中可能發(fā)揮著重要的功能，可能對生殖的成功具有重要的意義。對人特異基因的研究也為生殖疾病特別是妊娠疾病的防治提供了更深層次的理論基礎。
　　第二部分 microRNA-205和 CHN1在宮頸癌中的功能研究
　　宮頸癌是全球女性癌癥死亡的首要原

6、因。但是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機制仍然不是非常清楚。本部分研究的目的是闡明miR-205和CHN1蛋白在宮頸癌發(fā)展中的作用。在研究中發(fā)現(xiàn)，與宮頸正常上皮相比較，miR-205和CHN1蛋白的表達水平，在宮頸癌組織中被上調。我們用原位雜交的方法再次證實了在宮頸癌中miR-205的表達被上調。通過生物信息學預測及在HeLa細胞中雙熒光素酶基因報告檢測， CHN1是miR-205的靶基因。不同尋常的是，在宮頸癌細胞系HeLa、SiHa及C33A中，

7、miR-205的過表達上調了CHN1 mRNA及蛋白水平的表達，相反，miR-205的敲降能夠下調CHN1 mRNA及蛋白水平的表達。這些結果表明在宮頸癌中miR-205可能正向調控著CHN1的表達。miR-205的過表達促進了宮頸癌細胞的增殖、凋亡、遷移及侵襲能力，相反，miR-205的敲降則起到了抑制的作用。此外，CHN1的敲降也明顯的抑制了miR-205過表達對細胞行為的改變。這也進一步表明miR-205可能通過正向調控CHN1的

8、表達而影響宮頸癌細胞的行為。通過免疫組織化學法檢測宮頸癌組織芯片中CHN1的表達，我們發(fā)現(xiàn)CHN1表達的強弱與宮頸癌的淋巴結轉移有顯著性的關聯(lián)。總之，我們的實驗結果表明miR-205通過正向調控CHN1的表達，影響了宮頸癌細胞的生長、凋亡、遷移及侵襲能力。由此推測，miR-205的表達異常及后續(xù)的CHN1表達的異常在宮頸癌的發(fā)生中發(fā)揮著重要的作用。
　　第三部分 HIF1A與VEGF在月經發(fā)生過程中的表達
　　月經是子宮內膜

9、周期性脫落，脫落物隨著經血排出體外的生理現(xiàn)象，主要出現(xiàn)于包括人類的高等靈長類以及少數(shù)其它胎盤動物種屬中。月經的異常與很多婦科疾病的發(fā)生有關。解析子宮內膜周期性崩解出血機制是理解月經異常的關鍵所在，對女性生殖健康具有重大的意義。
　　本部分研究試圖通過建立小鼠月經樣模型，研究月經過程相關基因的表達變化。本研究成功的建立了小鼠生理性孕酮撤退月經樣模型。在小鼠月經樣模型中，在P4撤退后，Hif1a的mRNA與蛋白水平的表達都出現(xiàn)了上調，