STOML-2在宮頸癌中的表達(dá)及其功能研究.pdf

1、背景
　　 宮頸癌是世界范圍內(nèi)女性最常見的第三大腫瘤，在我國宮頸癌居女性生殖道惡性腫瘤的首位。在過去的幾十年中，盡管影像學(xué)技術(shù)、外科手術(shù)、化療和放療取得了很大的進(jìn)步，但是對于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移癌的病人治療效果依然不盡人意。因此急切需要找到有意義的分子標(biāo)志，為宮頸癌的診斷治療措施開辟新的途徑。
　　 STOML-2是新近發(fā)現(xiàn)的stomatin家族的一員，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，對惡性腫瘤的作用尚不明確。對其功能研究不多，尚處于初步研

2、究階段，有限的研究表明STOML-2具有穩(wěn)定線粒體膜、參與線粒體融合、調(diào)節(jié)線粒體離子通道的功能。
　　 目的
　　 分析STOML-2在宮頸癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，探討STOML-2在宮頸癌中的生物學(xué)功能。
　　 材料和方法
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　 宮頸痛細(xì)胞株HeLa、SiHa、C33A、Caski、Hcc94，由中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院實驗研究部631室保存，用加入了10％FBS(

3、Hyclone)的DMEM或1640(Gibco)培養(yǎng)。
　　 2.組織標(biāo)本
　　 收集中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院1999年～2005年的宮頸癌標(biāo)本300例、10例正常宮頸組織標(biāo)本以及19例宮頸癌患者的新鮮手術(shù)標(biāo)本，包括癌組織及對應(yīng)的癌旁組織。
　　 3.RT-PCR和Westernblot
　　 在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平檢測STOML-2的表達(dá)。
　　 4.免疫組化
　　 采用免疫組化(LSAB)的方法檢

4、測300例宮頸癌組織、10例正常宮頸組織的表達(dá)及19例宮頸癌患者癌組織和對應(yīng)癌旁組織的表達(dá)。
　　 5.siRNA的設(shè)計
　　 應(yīng)用siRNA設(shè)計軟件初篩出9對siRNA，再通過BLAST分析剔除與其他編碼基因有同源性的siRNA，最后經(jīng)RNA結(jié)構(gòu)分析軟件分析將對應(yīng)的基因序列位于二級結(jié)構(gòu)的siRNA去掉，選出三條對靶向STOML-2的siRNA。
　　 6.瞬時轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa、HCC94細(xì)胞
　　 采

5、用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將STOML-2-siRNA轉(zhuǎn)染HeLa、HCC94細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48小時后進(jìn)行相應(yīng)檢測。
　　 7.Western-blot檢測干擾后STOML-2的蛋白表達(dá)水平
　　 8.AnnexinV-FITC/PI、TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況
　　 9.統(tǒng)計學(xué)方法
　　 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(-x)±s）表示。STOML-2在宮頸癌組織中的表達(dá)及STOML-2

6、與宮頸癌癌各臨床病理因素的相互關(guān)系采用x2檢驗。采用Logistic回歸模型分析盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的危險因素。采用Kaplan-Meier法，Log-Rank檢驗比較生存曲線的差異。采用Cox比例風(fēng)險模型分析影響生存預(yù)后的因素。采用獨立樣本t檢驗比較凋亡實驗各組間差異。各檢驗過程均以P＜0.05(雙側(cè)檢驗)認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果
　　 1.STOML-2在宮頸癌細(xì)胞株中高表達(dá)
　　 宮頸痛細(xì)胞株HeLa、

7、SiHa、C33A、Caski、Hcc94中STOML-2在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達(dá)高于正常對照組織。
　　 2.STOML-2在宮頸癌組織中高表達(dá)
　　 在19對宮頸癌病人組織中，癌組織的STOML-2在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平都比對應(yīng)的癌旁組織表達(dá)高，比值都在2倍以上。
　　 3.STOML-2在宮頸癌中高表達(dá)且與SCCA、深肌層浸潤、淋巴脈管浸潤、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，是獨立的預(yù)后因子。SCCA與STOML-2是盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)

8、移的高危因素。
　　 STOML-2的高表達(dá)與宮頸癌的SCCA(x2=9.014，P=0.003)、深肌層浸潤（x2=5.321，P=0.021）、淋巴脈管浸潤（x2=4.050，P=0.044）、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(x2=38.668，P＜0.001)相關(guān)。STOML-2的陽性表達(dá)與其年齡、性別、Figo分期、腫瘤大小、病理分類、病理分級、宮旁浸潤無顯著相關(guān)性。Logistic回歸模型多因素分析顯示治療前SCCAg≧1.5ng

9、ml(P＜0.001，OR=5.361)、STOML-2表達(dá)(P＜0.001，OR=6.810)為盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移獨立的危險因素。Kaplan-Meier法分析5年生存曲線，STOML-2低表達(dá)的宮頸癌患者5年生存率為92％，而STOML-2高表達(dá)的宮頸癌患者5年生存率僅為78％，STOML-2低表達(dá)組的總體生存率優(yōu)于STOML-2高表達(dá)組，統(tǒng)計學(xué)上（Log-Rank檢驗）有顯著性差異(x2=11.615,P=0.001)，且隨著STOM

10、L-2表達(dá)的增強(qiáng)，總體生存曲線有逐漸下降的趨勢。COX回歸分析顯示STOML-2表達(dá)對預(yù)后有影響(P=0.001,RR=3.881)。
　　 4.RNAi沉默STOML-2表達(dá)后，對細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　 RNA干擾48小時后，使用順鉑誘導(dǎo)HeLa、HCC94細(xì)胞凋亡，當(dāng)達(dá)到半數(shù)細(xì)胞死亡時，行TUNEL法、AnnexinV法檢測。結(jié)果顯示，STOML-2被沉默后，HeLa、HCC94細(xì)胞的凋亡數(shù)增多，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異

11、。
　　 結(jié)論
　　 1.STOML-2在宮頸癌細(xì)胞株、癌組織中高表達(dá)且與SCCA、深肌層浸潤、
　　 淋巴脈管浸潤、盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且是宮頸痛獨立不良預(yù)后因子;
　　 2.STOML-2是宮頸癌盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨立危險因素;
　　 3.STOML-2沉默后，HeLa、HCC94細(xì)胞株凋亡增多，可能作為一種腫瘤進(jìn)展基因起作用，其在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮抗凋亡作用;
　　 4.S