E2-EPF在宮頸癌中的表達(dá)、功能及其機(jī)制研究.pdf

1、E2-EPF是E2泛素結(jié)合酶家族成員之一,分子量為24KD,在多種腫瘤組織中高表達(dá)。E2泛素結(jié)合酶同E1泛素激活酶,以及E3水解酶一起,催化蛋白質(zhì)泛素化,進(jìn)而被蛋白酶小體降解。腫瘤抑制因子pVHL是E3泛素水解酶復(fù)合體的一部分,它可使HIF等降解。E2-EPF泛素結(jié)合酶可使pVHL發(fā)生水解,進(jìn)而使得HIF-1()表達(dá)水平增強(qiáng)。HIF-1()作為細(xì)胞低氧應(yīng)答反應(yīng)中起核心作用的轉(zhuǎn)錄因子,能調(diào)節(jié)100多種與低氧應(yīng)激下細(xì)胞適應(yīng)和存活相關(guān)的靶基因

2、。HIF-1()是參與腫瘤增殖、血管增生、轉(zhuǎn)移等過(guò)程的重要分子。E2-EPF泛素結(jié)合酶表達(dá)水平增高,可通過(guò)pVHL-HIF-1()途徑促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　 E2-EPF在宮頸癌細(xì)胞中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道,本研究旨在闡明E2-EPF在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平和功能。主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　 一、E2-EPF在宮頸鱗狀細(xì)胞癌組織中高表達(dá)
　　 選取了宮頸鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本75例,正常宮頸組織13例為研究對(duì)象,采用

3、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)E2-EPF mRNA表達(dá)水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中E2-EPF mRNA水平是正常宮頸組織的4.08倍；Ⅱ期以上宮頸癌組織中E2-EPF的mRNA表達(dá)水平是Ⅰ期的2.72倍,二者均具有顯著差異。由此可見(jiàn),E2-EPF在宮頸癌組織中也呈高表達(dá)狀態(tài),并且與腫瘤細(xì)胞的惡性程度有一定的相關(guān)。
　　 二、宮頸癌細(xì)胞系SIHA E2-EPF低表達(dá)克隆的建立
　　 采用商品化E2-EPF shRNA質(zhì)粒載體

4、下調(diào)細(xì)胞內(nèi)源性E2-EPF。通過(guò)脂質(zhì)體將E2-EPFshRNA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染入SIHA細(xì)胞,并通過(guò)嘌呤霉素篩選獲得了穩(wěn)定的E2-EPF低表達(dá)克隆,共篩選獲得15個(gè)E2-EPF低表達(dá)克隆,mRNA水平下降可達(dá)到正常SIHA細(xì)胞的18％左右,蛋白水平降至正常水平的20％左右。
　　 三、E2-EPF下降后導(dǎo)致HIF-1()的表達(dá)下降
　　 由于HIF-1α在常氧狀態(tài)下極不穩(wěn)定,常規(guī)的方法不易檢測(cè)到HIF-1α的存在。本實(shí)驗(yàn)采用

5、熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)成功的檢測(cè)到微量的HIF—1α。結(jié)果顯示,E2-EPF的表達(dá)與HIF-1a成正相關(guān),低表達(dá)克隆細(xì)胞內(nèi)HIF-1a水平較正常對(duì)照組明顯降低。
　　 四、E2-EPF下調(diào)后對(duì)細(xì)胞周期、增殖及侵襲性生物學(xué)特性的影響
　　 采用MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),E2-EPF低表達(dá)克隆細(xì)胞的增殖速度顯著低于正常和對(duì)照細(xì)胞。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),E2-EPF低表達(dá)克隆細(xì)胞其克隆形成能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常和對(duì)照細(xì)胞。以流式細(xì)胞術(shù)

6、檢測(cè)細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn),E2-EPF低表達(dá)克隆細(xì)胞的G0-G1期細(xì)胞百分比顯著增加,S和G2-M期(尤其是S期)細(xì)胞數(shù)減少,細(xì)胞增殖減慢。采用經(jīng)典的Transwell小室研究E2-EPF對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響發(fā)現(xiàn),E2-EPF低表達(dá)克隆細(xì)胞穿膜細(xì)胞較正常和對(duì)照細(xì)胞明顯減少。本部分研究結(jié)果說(shuō)明,E2-EPF下調(diào)后對(duì)SIHA細(xì)胞的細(xì)胞周期、增殖及侵襲性等生物學(xué)行為具有顯著的影響。
　　 五、E2-EPF下調(diào)對(duì)放、化療的影響
　　 細(xì)

7、胞經(jīng)0Gy,4 Gy,7 Gy,10 Gy4個(gè)不同劑量X線照射后,采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)數(shù)量,發(fā)現(xiàn)不同劑量下,E2-EPF低表達(dá)克隆細(xì)胞的存活數(shù)量和正常、對(duì)照組細(xì)胞沒(méi)有顯著差異。采用Annexin-Ⅴ、PI聯(lián)合的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)現(xiàn),各個(gè)劑量下,細(xì)胞凋亡和死亡的數(shù)量在各組之間沒(méi)有差異。說(shuō)明E2-EPF下調(diào)后,對(duì)細(xì)胞的放療耐受性沒(méi)有顯著影響。
　　 采用不同機(jī)理化療藥物:順鉑、紫杉醇、多烯紫杉醇、拓?fù)涮婵?、依托泊苷、表阿?/p>

8、素,以不同濃度分別加入各組細(xì)胞中,觀察E2-EPF下調(diào)后是否對(duì)化療藥物療效有一定影響。采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活的相對(duì)數(shù)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn):降調(diào)內(nèi)源性E2-EPF水平,可以增加細(xì)胞對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ抑制劑——拓?fù)涮婵?拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ抑制劑——依托泊苷和表阿霉素的敏感性,但是對(duì)順鉑、紫杉醇和多烯紫杉醇的作用無(wú)明顯影響。以上試驗(yàn)說(shuō)明,E2-EPF下降后增加了部分化療藥物的療效,可以作為宮頸癌化療聯(lián)合用藥的一種增效途徑。
　　 六、E2-EPF下調(diào)

9、后裸鼠成瘤能力顯著下降
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)接種一定數(shù)量的腫瘤細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)E2-EPF低表達(dá)組腫瘤生長(zhǎng)速度減慢、瘤體大小減小。E2-EPF低表達(dá)組平均瘤體重量?jī)H相當(dāng)于對(duì)照組的1/4,這就提示E2-EPF在腫瘤的發(fā)展中具有重要的作用。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說(shuō)明降調(diào)E2-EPF的表達(dá)可以作為晚期宮頸癌生物學(xué)治療的重要方法。
　　 結(jié)論:E2-EPF在宮頸癌組織中成高表達(dá)狀態(tài),且其表達(dá)量的高低和臨床腫瘤分級(jí)具有一定的相關(guān)性。通過(guò)RNAi下調(diào)