MicroRNA在乳腺癌血清中的異常表達及mir-205功能的初步研究.pdf

1、背景:MircoRNAs(miRNAs)是一類短序列、非編碼、具有調(diào)控功能的單鏈小分子RNA,長約20-24 nt,由一段具有發(fā)夾樣環(huán)狀結(jié)構(gòu)、長約70-80 nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)經(jīng)過Dicer酶加工后生成。miRNAs通過與其靶mRNA分子的3’端非編碼區(qū)(3'-UTR)互補結(jié)合,在翻譯水平上特異性抑制基因表達,參與調(diào)控生物生長和發(fā)育等許多復(fù)雜的生命過程。許多miRNAs的序列在起源甚遠的物種之間相對保守,雖然這些

2、miRNAs的生物學功能目前還不十分清楚,但可以肯定的是它們有不同的表達模式,同時參與調(diào)節(jié)各種生理病理過程。異常的miRNAs表達與人類某些疾病包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展都密切相關(guān),miRNAs被認為是一組新的癌或抑癌基因,其表達具有特異性的腫瘤組織表達譜。循環(huán)核酸(CNA)是指存在于血液(血清或血漿)等體液中的細胞外游離DNA和RNA,與生理和病理狀態(tài)下的細胞代謝密切相關(guān),循環(huán)DNA和RNA水平的檢測及其在基因診斷等方面的應(yīng)用對于惡性腫瘤等疾

3、病的診斷和監(jiān)測具有十分重要的意義。近期人們在進行循環(huán)DNA、RNA分子檢測的同時,在miRNAs方面也做了許多的工作,研究結(jié)果使得與腫瘤相關(guān)的核酸分子檢測這一領(lǐng)域變的更加讓人振奮。在血液中檢出腫瘤特異性的miRNAs并將其作為腫瘤的生物學標志物對于早期診斷腫瘤具有至關(guān)重要的意義。
　　 目的:
　　 1.建立起從血清中提取miRNA的方法,并檢測mir-21、mir-200c、mir-205在乳腺癌患者和健康對照人群血清

4、中的表達差異情況。
　　 2.了解mir-205對乳腺癌細胞系MCF-7生長和凋亡的影響。
　　 3.結(jié)合生物信息學技術(shù)預(yù)測miR-205的靶基因,為理解mir-205在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供依據(jù)。
　　 4.通過本研究,希望為乳腺癌的治療提供新的分子靶點,為乳腺癌相關(guān)的診斷、預(yù)后標志物研究提供新的內(nèi)容。
　　 方法：
　　 1.利用實時熒光定量RT-PCR技術(shù),檢測并比較mir-21、mir

5、-200c、mir-205在乳腺癌病人和健康對照人群血清中的表達差異。
　　 2.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù),上調(diào)mir-205在MCF-7細胞中的表達。利用熒光顯微鏡和熒光定量RT-PCR技術(shù)檢測該方法的有效性。利用MTT法分析轉(zhuǎn)染前后細胞增殖活性的變化；流式細胞PI法分析轉(zhuǎn)染前后細胞生長周期的變化；流式細胞儀FITC-AnnexinV/PI法分析轉(zhuǎn)染前后細胞凋亡的變化。
　　 3.應(yīng)用不同的生物信息學方法對在乳腺癌細胞系MC

6、F-7中表達下調(diào)的miR-205的靶基因進行預(yù)測。
　　 結(jié)果：
　　 1.利用實時熒光定量RT-PCR法,對10例乳腺癌患者和3例健康對照人群的血清miRNA進行了檢測,成功從乳腺癌患者和健康對照人群的血清中提取出miRNA,發(fā)現(xiàn)相對于對照組,乳腺癌患者血清中mir-200c的表達上調(diào),mir-205表達下調(diào),差異有統(tǒng)計學意義。
　　 2.本實驗利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miRNA mimics的實驗技術(shù),其上調(diào)miRNA

7、的有效性得到證實。發(fā)現(xiàn)上調(diào)mir-205表達水平以后會降低乳腺癌細胞MCF-7的增殖活性,增加細胞凋亡率,而對細胞周期無明顯影響。
　　 3.應(yīng)用miRBase、Pictar和Targetscan三大經(jīng)典靶基因預(yù)測軟件對miR-205進行靶基因預(yù)測,在至少兩個以上軟件預(yù)測出的靶基因有113個。其多個基因涉及細胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞增殖、分化和細胞凋亡等眾多生物學過程,說明miR-205在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中有著重要的生物學功能。

8、r>　　 結(jié)論：
　　 1.利用Trizol法和實時熒光RT-PCR方法能夠成功提取乳腺癌患者和健康對照人群血清中的miRNA,并且發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血清中mir-200c的表達上調(diào),mir-205表達下調(diào),有可能作為乳腺癌早期診斷的腫瘤分子標志物。
　　 2.mir-205可降低乳腺癌細胞的增殖活性,增加凋亡率,但不影響細胞周期。
　　 3.生物信息學預(yù)測miR-205可能通過調(diào)控下游一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯引起