MiR-205在腎透明細胞癌中的表達及作用機制研究.pdf

1、[研究背景]
　　腎癌(renal cell carcinoma，RCC)是常見的泌尿系惡性腫瘤，其發(fā)病率位居泌尿系腫瘤的第二位，僅次于膀胱癌，占全身惡性腫瘤的3％。腎癌的組織分型中以腎透明細胞癌(clear cell renal cellcarcinoma, ccRCC)最為多見，約占80-85％。目前對于早期腎癌，根治性腎切除的治療效果確切，但對于已發(fā)生浸潤轉(zhuǎn)移的晚期腎癌患者或術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移患者仍缺乏十分有效的治療手段，其5年生

2、存率均低于9％。既往的研究表明，RCC的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多步驟的復(fù)雜過程，其中涉及眾多的癌基因、抑癌基因和生長因子的激活或異常表達。因此，闡明RCC發(fā)生發(fā)展的分子遺傳機制并在此基礎(chǔ)上探索新的早期診斷和治療方法具有重要意義。
　　微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼調(diào)控的單鏈小RNA分子，長度約22個核苷酸。miRNAs介導(dǎo)的基因調(diào)控發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平，通過與其靶mRNA分子的3'非翻譯區(qū)(3'un-tr

3、anslated region，3'UTR)互補配對，使靶mRNA分子的翻譯受到抑制或直接降解靶mRNA，從而對靶基因的表達起負性調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs不僅參與了個體的生長、發(fā)育、凋亡、分化等多種生理過程，在機體多種病理過程中也發(fā)揮著重要作用，包括腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。最近多項研究證實，miRNAs在RCC的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，可通過直接靶向作用一些癌基因或抑癌基因而調(diào)控RCC細胞的生長、凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為。盡管miR

4、NAs在RCC發(fā)生發(fā)展調(diào)控中的重要性業(yè)已吸引了國內(nèi)外眾多學(xué)者的關(guān)注，絕大多數(shù)miRNAs在RCC中的作用及其作用機制依然未知，迫切需要進一步研究。
　　為了探索miR-205與腎透明細胞癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，我們在本研究首先利用實時定量PCR檢測了腎透明細胞癌組織及癌旁非腫瘤組織中miR-205的表達情況，并研究其與腎癌臨床分期、病理分級之間的關(guān)系。然后檢測了miR-205在各腎癌細胞株及正常腎小管上皮細胞株中的表達情況，并以此篩選

5、出合適的腎癌細胞株作為體外研究對象，研究miR-205對腎癌細胞生長、凋亡、侵襲遷移等生物學(xué)行為的影響。最后用生物信息學(xué)預(yù)測miR-205可能的靶基因，并用體外實驗進行初步驗證，探討miR-205在腎透明細胞癌中可能的作用機制，為腎癌的診斷和治療提供新的思路。
　　[方法與結(jié)果]
　　1.miR-205在腎透明細胞癌組織中的表達水平顯著下調(diào):采用實時定量PCR檢測20例ccRCC組織及癌旁非腫瘤組織中miR-205的相對表達

6、量，結(jié)果miR-205在ccRCC組織組織中的表達顯著低于癌旁非腫瘤組織(3.60±1.92 vs6.39±3.39，P＜0.05)。
　　2.miR-205的低表達與腎癌臨床分期、病理分級無相關(guān):根據(jù)病理分級和臨床分期分別將20例ccRCC組織樣本進行分組并比較各組之間miR-205的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高分化組(n=12)與中-低分化組(n=8)、Ⅰ期(n=13)與Ⅱ-Ⅲ期(n=7)之間miR-205的相對表達量均無顯著差異（分別為

7、3.66±2.24 vs3.51±1.42和3.73±2.16 vs3.36±1.48，P＞0.05）。
　　3.過表達miR-205抑制ACHN細胞的生長和侵襲轉(zhuǎn)移、誘導(dǎo)凋亡:利用實時定量PCR檢測腎癌細胞株Caki-1、ACHN及正常腎小管上皮細胞HK-2中mir-205的表達，結(jié)果顯示，miR-205在Caki-1、ACHN細胞中的相對表達量均顯著低于HK-2細胞（分別為1.32±0.13、1.06±0.13、3.95±0.

8、37，P＜0.05），且在ACHN細胞中的表達水平最低。選取ACHN作為研究對象，使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染miR-205mimics于ACHN株，升高miR-205的表達。實驗分組:空白對照組(B.C)、miR-205陰性對照組(N.C)、miR-205模擬物轉(zhuǎn)染組(miR-205)，實時定量PCR檢測各組miR-205的表達水平，MTT法、AnnexinⅤ&PI雙染法、流式細胞術(shù)(FCM)、Transwell細胞

9、侵襲實驗和遷移實驗分別觀察各組ACHN細胞增殖、凋亡、細胞周期、侵襲能力的變化，結(jié)果顯示，miR-205組中miR-205的相對表達含量顯著高于B.C組、N.C組（依次為3.95±1.15、1.35±0.51、1.37±0.41，P＜0.05）;MTT結(jié)果顯示與B.C組、N.C組相比，miR-205組ACHN細胞生長出現(xiàn)明顯抑制(P＜0.05);凋亡實驗結(jié)果顯示miR-205組ACHN細胞的凋亡率明顯高于B.C組、N.C組（依次為12.

10、37±1.38％、3.53±0.61％、3.72±0.66％，P＜0.05）;流式細胞周期分析顯示與B.C組、N.C組相比，miR-205組處于亞G1期中的細胞數(shù)明顯升高，而相應(yīng)S期中細胞數(shù)目卻出現(xiàn)明顯減少(P＜0.05); Transwell侵襲和遷移實驗結(jié)果顯示，miR-205組細胞侵襲和遷移能力較B.C組、N.C組明顯下降（P＜0.05）。
　　4.miR-205可能直接靶向調(diào)控E2F1和ZEB2:利用miRbase、Tar

11、getScan、miRanda等生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-205可能的靶基因E2F1、ZEB2，實時定量PCR和Western blot分別檢測ACHN、Caki-1、HK2細胞中E2F1和ZEB2的表達及過表達miR-205對ACHN細胞中E2F1和ZEB2表達的影響，結(jié)果顯示，ACHN、Caki-1細胞中E2F1和ZEB2在mRNA和蛋白表達水平均顯著高于HK2（P＜0.05）。miR-205組中ZEB2在mRNA和蛋白表達水平均顯

12、著低于B.C組、N.C組（P＜0.05），miR-205組中E2F1蛋白表達水平顯著低于B.C組、N.C組（P＜0.05），但E2FlmRNA在三組中的表達無明顯差異（P＞0.05）。
　　5.miR-205可能通過E2F1調(diào)控AKT信號通路:利用Western blot分別檢測B.C組、N.C組、miR-205組中AKT、pAKT、BAD、pBAD蛋白的表達，結(jié)果顯示，miR-205組中pAKT和pBAD蛋白表達含量顯著低于B.

13、C組、N.C組(P＜0.05)，而AKT和BAD蛋白表達含量在三組中無明顯差異（P＞0.05）。
　　6.miR-205可能通過ZEB2調(diào)控EMT:采用免疫組化法檢測20例ccRCC及癌旁非腫瘤組織中E-cadherin和Vimentin的表達，實時定量PCR法和Western blot法檢測ACHN、Caki-1、HK2中E-cadherin、Vimentin的表達及過表達miR-205對ACHN細胞中E-cadherin、Vi

14、mentin表達的影響，結(jié)果顯示，ccRCC組織中E-cadherin陽性率明顯低于癌旁非腫瘤組織(35％ vs75％，P＜0.05)，ccRCC組織中Vimentin陽性率明顯高于癌旁非腫瘤組織(80％ vs25％，P＜0.05)。ACHN、Caki-1細胞中E-cadherin在mRNA和蛋白表達水平均顯著低于HK2(P＜0.05)，ACHN、Caki-1細胞中Vimentin在mRNA和蛋白表達水平均顯著高于HK2(P＜0.05)

15、。miR-205組中E-cadherin在mRNA和蛋白表達水平均顯著高于B.C組、N.C組（P＜0.05），miR-205組中Vimentin在mRNA和蛋白表達水平均顯著低于B.C組、N.C組（P＜0.05）。
　　[結(jié)論]
　　1.在ccRCC組織中miR-205的表達顯著下調(diào)，提示miR-205可能與ccRCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-205表達水平的檢測可能有助于腎透明細胞癌的診斷。miR-205表達水平與ccR

16、CC的臨床分期及病理分級無顯著相關(guān)。
　　2.miR-205在人腎癌細胞株ACHN、Caki-1中的表達顯著低于人正常腎小管上皮細胞株HK-2中的表達。has-miR-205 mimics能有效轉(zhuǎn)染人腎癌細胞株ACHN，并升高ACHN細胞中miR-205的表達。
　　3.過表達miR-205能夠有效抑制ACHN細胞的增殖及侵襲遷移能力，促進ACHN細胞的凋亡，提示miR-205在腎癌中發(fā)揮抑癌基因的作用，上調(diào)miR-205表