乳腺癌異常鞘糖脂的表達及其功能的研究.pdf

1、本文對乳腺癌異常鞘糖脂的表達及其功能進行了研究。本研究分為兩個部分：
　　第一章：乳腺癌患者組織樣本中中性鞘糖脂Fuc-ɑ1,2 LacCer的表達。
　　目的：本課題研究乳腺癌患者癌組織中主要中性鞘糖脂的表達情況,并與成對的癌旁組織表達的中性鞘糖脂作對比,尋找在乳腺癌中異常表達的鞘糖脂。進而探討其與乳腺癌的相關性和生物學功能。
　　方法：⑴采取有機溶劑超聲波提取的方法提取乳腺癌患者癌組織和對應的癌旁組織樣本中的總鞘糖

2、脂,通過Sephadex A-25柱分離得到中、酸性鞘糖脂。⑵將分離得到的中性鞘糖脂經過甲基化修飾反應后進行質譜(ESI-LIT-MS)分析。對所得甲基化的中性鞘糖脂進行一級質譜(MS1)和多級質譜(MSn)定性分析,確定各主要中性鞘糖脂的種類及具體結構,對比癌組織與對應的癌旁組織尋找異常表達的鞘糖脂。⑶將結構初步確定的異常鞘糖脂與標準品的質譜結果進行對比分析;將甲基化的中性鞘糖脂進行液相-質譜分析(LC-MS);將癌組織中性鞘糖脂經相

3、關糖基酶(ɑ1,2 fucosidase)處理后質譜分析。綜合三方面結果確定異常表達的鞘糖脂的結構。⑷將主要中性鞘糖脂和異常表達鞘糖脂在所有的癌組織和對應癌旁組織中的相對含量進行分析比較;對異常表達鞘糖脂進行前離子掃描質譜含量分析,對比分析癌組織和對應癌旁組織前離子掃描結果;將乳腺癌組織樣本中表達異常鞘糖脂在一級質譜圖上的信噪比(SNR)與癌旁組織、白血病骨髓樣本和肝癌組織樣本分析比較;將異常表達的鞘糖脂進行ROC分析確定其臨床診斷意義

4、;對不同分子分型的乳腺癌異常表達的鞘糖脂含量進行比較分析。綜合以上分析結果確定異常表達鞘糖脂與乳腺癌的關聯性。
　　結果：①經過一級和多級質譜鑒定,確定乳腺癌癌組織和癌旁組織樣本中的主要中性鞘糖脂為 GlcCer, LacCer, globotrihexosylceramide(Gb3), globotetraglycosylceramide(Gb4)。癌組織中性鞘糖脂一級質譜圖中的峰1184是Fucosyl-Lactoceram

5、ide(Fuc-ɑ1,2 LacCer)。另外,前人研究的乳腺癌相關標志物Globo-H(Fucosyl-Gb4)也在乳腺癌癌組織樣本中檢測到。②對主要中性鞘糖脂的相對含量比較得出:GlcCer和Gb3在癌旁組織中表達量較高,LacCer, Globo-H和Fuc-ɑ1,2 LacCer在癌組織中高表達。③SNR分析得出:與白血病和肝癌相比,Fuc-ɑ1,2 LacCer特異性地表達在乳腺癌組織中。ROC分析得出:Fuc-ɑ1,2 La

6、cCer作為一個臨床診斷指標具有一定的靈敏性和特異性。
　　結論：Fuc-ɑ1,2 LacCer在乳腺癌組織中顯著高表達且具有特異性;Fuc-ɑ1,2 LacCer作為診斷指標具有一定的臨床意義。
　　第二章：乳腺癌細胞系中鞘糖脂Fuc-ɑ1,2 LacCer及其功能的研究。
　　目的：觀察 Fuc-ɑ1,2 LacCer在多種乳腺癌細胞系中的表達情況,研究Fuc-ɑ1,2 LacCer及相關生物合成酶含量的變化對乳腺

7、癌細胞生物學功能的影響,探討Fuc-ɑ1,2 LacCer及相關生物合成酶在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的生物學意義。
　　方法：⑴對比多種人乳腺癌細胞系、人白血病細胞系、人肝癌細胞系及人外周血單核細胞中該鞘糖脂的表達情況。⑵通過RT-PCR及Realtime PCR檢測乳腺癌細胞系中Fuc-ɑ1,2 LacCer相關合成酶(巖藻糖基轉移酶)表達情況。篩選出巖藻糖基轉移酶1(FUT1)高表達和低表達的細胞系作為后續(xù)功能實驗的工具細胞系。⑶通過

8、Western Blot方法檢測乳腺癌組織樣本中巖藻糖基轉移酶(FUT1)表達情況。⑷采用RNA干擾技術(RNAi),對巖藻糖基轉移酶高表達的細胞系進行基因沉默;構建表達FUT1的質粒(pEGFPN1-FUT1),對巖藻糖基轉移酶低表達的細胞系進行基因過表達操作。對轉染后的細胞進行鞘糖脂分析,并對細胞的遷移能力進行檢測。
　　結果：①對多種不同腫瘤細胞系及人正常細胞Fuc-ɑ1,2 LacCer相對含量比較分析,得出Fuc-ɑ1,

9、2 LacCer在乳腺癌細胞系中表達水平明顯高于其他細胞。②FUT1在MDA-MB-157和MDA-MB-453中表達量較高,在MDA-MB-231和 MCF-7中表達量較低。選取 MDA-MB-453和 MCF-7分別作為 FUT1基因沉默和過表達的工具細胞系。③與相應的癌旁組織相比,FUT1在乳腺癌癌組織中表達量較高。④過表達FUT1后,MCF-7中Fuc-ɑ1,2 LacCer表達量顯著上升,遷移能力有所增強。
　　結論：F