金花茶體胚發(fā)生的調(diào)控及其解剖學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、本試驗(yàn)以金花茶(Camellia nitidissima Chi.)成年材料離體再生體系為材料來(lái)源，進(jìn)行了體胚發(fā)生調(diào)控、發(fā)育解剖學(xué)觀察，并對(duì)金花茶正常體胚發(fā)育和花狀多子葉形胚體胚發(fā)育途徑不同階段的離體培養(yǎng)材料進(jìn)行了蛋白質(zhì)表達(dá)的雙向電泳分析。金花茶花狀多子葉形胚這一異常發(fā)育途徑，是植物離體形態(tài)發(fā)生的一種特殊現(xiàn)象，在其他植物上未見(jiàn)報(bào)道。對(duì)該現(xiàn)象的研究，有助于了解植物離體形態(tài)過(guò)程的一些特殊機(jī)制，對(duì)完善發(fā)育生物學(xué)理論有重要意義。 本試驗(yàn)

2、主要研究結(jié)果如下： 1、比較了不同激素組合對(duì)金花茶愈傷組織誘導(dǎo)的影響。發(fā)現(xiàn)將本實(shí)驗(yàn)室原有的金花茶體胚增殖再生系統(tǒng)中獲得的子葉胚切塊后接種在附加2mg/L 2,4-D和1mg/L KT的培養(yǎng)基上每7d繼代一次，誘導(dǎo)出的部分愈傷組織，在不添加激素的分化培養(yǎng)基上分化出體胚，并且相當(dāng)數(shù)量都是花狀多子葉形胚類(lèi)型。 2、建立了金花茶花狀多子葉形胚發(fā)育途徑的體胚循環(huán)再生系統(tǒng)。通過(guò)逐步提高培養(yǎng)基滲透壓，經(jīng)過(guò)逐代篩選，在附加0.22mol

3、/L甘露醇和0.12mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基上獲得基本一致的花狀多子葉胚。將體胚轉(zhuǎn)入附加0.2mol/L NAA和2mol/L BA的1/2 MS培養(yǎng)基中，體胚變紅甚至褐變，最后在褐變的胚體表面又生長(zhǎng)出較同步的同一類(lèi)型的次生胚。將其重新接種到原培養(yǎng)基上，又可重復(fù)這一發(fā)育途徑。 3、將花狀多子葉形胚不同發(fā)育階段的離體培養(yǎng)材料制作石蠟切片，并與正常發(fā)育的材料進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)了其組織形態(tài)上具有特殊性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)子葉向真葉的轉(zhuǎn)化是從兩端葉

4、緣向主脈方向進(jìn)行的。與擬南芥lec突變體比較，發(fā)現(xiàn)二者不是同一類(lèi)型的突變。 4、用雙向電泳的分析方法，得到了金花茶正常體胚發(fā)育途徑和花狀多子葉形胚體胚發(fā)育途徑球形胚、子葉胚、成熟胚和幼苗4個(gè)階段的離體培養(yǎng)材料以及2mg/L 2,4-D和1mg/LKT的激素組合誘導(dǎo)的愈傷組織的總蛋白的雙向電泳圖譜。 金花茶正常體胚發(fā)育途徑，從球形胚階段發(fā)育至子葉胚階段，明顯消失或減弱的蛋白有4個(gè)：CnPG1(63.9kD)、CnPG2(2

5、9.9kD)、CnPG3(30.6kD)、CnPG4(29.1kD)，其中CnPG2(29.9kD)、CnPG3(30.6kD)和CnPG4(29.1kD)從子葉胚階段開(kāi)始明顯減弱；而在子葉胚階段明顯新增的蛋白，有9個(gè)：CnPC1(73.3kD)、CnPC2(70.5kD)、CNPC3(35.4kD)、CNPC4(44.1kD)、CnPC5(28.4kD)、CnPC6(20.1kD)、CnPC7(19.1kD)、CnPC8(17.4kD

6、)、CnPC9(19.0kD)，其中CnPC1(73.3kD)和CnPC2(70.5kD)在隨后的發(fā)育進(jìn)程中逐漸減弱，在幼苗階段完全消失。從子葉胚發(fā)育至成熟胚階段，明顯消失或減弱的蛋白有25個(gè)CnPC10(58.4kD)、CNPC4(44.1kD)、CnPC11(48.1kD)、CnPC12(45.0kD)、CnPC13(40.0kD)、CnPC14(19.0kD)、CnPC15(42.1kD)、CnPC6(20.1kD)．CnPG4(

7、29.1kD)，CnPC7(19.1kD)，CnPCI6(23.0kD)、CnPCI7(18.8kD)、CnPC9(19.0kD),CnPC8(17.4kD)，CnPC18(21.3kD)、CnPC19(35.1kD)、CNPC20(29.2kD)、CnPC21(30.4kD)、CNPC22(20.7kD)、CNPC23(19.0kD)、CnPC24(18.9kD)、CNPC25(16.0kD)、CnPC26(32.6kD)、CNPC2

8、7(32.3kD)、CNPC28(28.4kD)。其中CNPC4(44.1kD)、CnPC6(20.1kD)、CnPC7(19.1kD)、CnPC8(17.4kD)和CnPC9(19.0kD)僅在子葉胚階段出現(xiàn)，CnPG4(29.1kD)在球形胚階段開(kāi)始明顯減弱，至子葉胚階段完全消失。而在成熟胚階段新出現(xiàn)的蛋白有3個(gè)CnPM1(21.0kD)、CnPM2(18.5kD)、CnPM4(15.3kD)，CnPM3(16.3kD)明顯增強(qiáng)。成

9、熟胚發(fā)育到幼苗階段，明顯消失的蛋白有16個(gè)：CnPM5(72.5kD)、CnPM6(73.1kD)、CnPM7(60.6kD)、CnPM8(71.1kD)、CnPG2(29.9kD)、CnPG3(30.6kD)、CnPM9(27.6kD)、CnPM1(21.0kD)、CnPMl0(21.5kD)、CnPM11(21.0kD)、CnPM12(20.0kD)、CnPM3(16.3kD)、CnPM13(15.7kD)、CnPM14(14.1k

10、D)、CnPM15(13.1kD)、CnPM16(12.2kD)。其中CnPM1(21.0kD)僅在成熟胚階段出現(xiàn)，CnPG2(29.9kD)和CnPG3(30.6kD)在球形胚階段開(kāi)始明顯減弱，至成熟胚階段則完全消失。而在幼苗階段新增的蛋白有5個(gè)：CnPP1(55.7kD)、CnPP3(57.2kD)、CnPP4(55.3kD)、CnPP5(55.3kD)、CnPP6(47.2kD)，CnPP2(57.5kD)雖然存在于正常體胚所有的

11、發(fā)育階段，但在幼苗階段的表達(dá)量特別大。而金花茶花狀多子葉形胚發(fā)育途徑蛋白表達(dá)變化的差異有：①CnPG5(31.4kD)在正常體胚發(fā)育過(guò)程中的球形胚階段就已經(jīng)出現(xiàn)：而在花狀多子葉形胚體胚發(fā)育過(guò)程中，則要到子葉胚階段才出現(xiàn)。②CnPC4(44.1kD)和CnPC5(28.4kD)在正常體胚發(fā)育過(guò)程中的子葉胚階段才出現(xiàn)；而在花狀多子葉形胚體胚發(fā)育過(guò)程中，在球形胚階段就已經(jīng)出現(xiàn)。③CnPG4(29.1kD)在正常體胚發(fā)育過(guò)程中的球形胚階段開(kāi)始減

12、弱，在進(jìn)入成熟胚階段前消失；而CnPG 4(29.1kD)在花狀多子葉形胚體胚發(fā)育過(guò)程中的球形胚階段的表達(dá)量就明顯低于正常發(fā)育的體胚，并且在子葉胚階段就已消失。④花狀多子形葉胚體胚發(fā)育過(guò)程的子葉胚至成熟胚階段，CnPP2(57.5kD)和CnPM17(46.4kD)在此期間消失；而正常體胚發(fā)育過(guò)程中這一時(shí)期沒(méi)有這一變化。⑤CnPM1(21.0kD)在花狀多子葉形胚體胚發(fā)育過(guò)程中未見(jiàn)表達(dá)。⑥CnPD(14.9kD)是花狀多子葉形胚體胚發(fā)育

13、過(guò)程中特有的蛋白，從球形胚至成熟胚階段一直穩(wěn)定存在：而正常體胚發(fā)育過(guò)程中，沒(méi)有見(jiàn)到該蛋白的表達(dá)。 兩種發(fā)育途徑最終獲得的幼苗占勺蛋白表達(dá)差異分析發(fā)現(xiàn)，正常體胚比花狀多子葉形胚多出5個(gè)蛋白：CnPPl(55.7kD)、CnPP5(55.3kD)、CnPP6(47.21kD)、CnPP7(16.1kD)、CnPM4(15.3kD)；而在花狀多子葉形胚幼苗階段，CnPC7(19.1kD)仍未消失。 金花茶愈傷組織與花狀多子葉形