柑橘體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程中多胺變化及其合成基因的表達(dá).pdf

1、體細(xì)胞胚胎發(fā)生是組織培養(yǎng)、遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)中一種主要的形態(tài)發(fā)生途徑，因此研究柑橘愈傷組織胚胎發(fā)生并建立高效胚胎發(fā)生體系是將生物技術(shù)應(yīng)用于柑橘遺傳改良的一個(gè)關(guān)鍵因子。多胺是一種強(qiáng)堿性、脂肪族多陽離子含氮化合物，在植物形態(tài)發(fā)生、生長發(fā)育及逆境應(yīng)答中具有重要的作用。而多胺與柑橘離體胚胎發(fā)生的關(guān)系研究尚顯不足，因此，本實(shí)驗(yàn)研究柑橘(伏今夏橙)胚胎發(fā)生中的多胺生物合成，主要結(jié)果如下： 1．培養(yǎng)基上誘導(dǎo)了伏令夏橙愈傷組織的體細(xì)胞胚胎發(fā)生，觀察

2、到10天就有一定數(shù)量的球形胚發(fā)生，20天有心形和魚雷胚的發(fā)生，30天有子葉胚的發(fā)生。用多胺合成抑制劑(D-arginine和DFMO)處理會(huì)抑制胚的發(fā)育，并且明顯的抑制子葉胚的形成，加外源腐胺后可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)抑制劑的作用。 2．石蠟切片顯微觀察了伏令夏橙不同時(shí)期的胚狀體。觀察到愈傷組織無序的細(xì)胞結(jié)構(gòu)到有序的胚狀體組織結(jié)構(gòu)，心形胚可以看見明顯的原形成層。 3．克隆了多胺合成中3個(gè)關(guān)鍵酶(ODC、SPMS和SPDS)的

3、同源基因片段，其大小分別是鳥氨酸脫羧酶(ODC) 522bp，亞精胺合成酶(SPDS)595bp，精胺合成酶(SPMS)307bp。 4．HPLC分析表明，培養(yǎng)在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MT+2％甘油)上的胚性愈傷組織中的腐胺比對(duì)照(MT)低，亞精胺和精胺在前20天高，后20天與對(duì)照沒有區(qū)別。用抑制劑(D-arginine和DFMO)處理后腐胺和亞精胺含量都降低，精胺有所增加。加外源腐胺后三種多胺含量都上升。 5．采用半定量RT-P