陸地棉體細胞胚胎發(fā)生過程中miRNAs及其靶標的鑒定和GhmiR157a-GhSPL10功能分析.pdf

1、體細胞胚胎發(fā)生體系是研究已分化組織和器官脫分化和再分化的良好模型，也是植物轉基因技術的重要依托，對于其機制的研究具有重要的理論和應用價值。microRNAs(miRNAs)是一類長度通常為19-25個核苷酸(nt)的內源非編碼RNA，在植物的生長發(fā)育，激素信號轉導，逆境脅迫響應等方面起著重要的作用。然而棉花中關于miRNAs的研究較少;本研究基于實驗室前期篩選的一個高效體細胞胚胎發(fā)生的材料YZ1，利用小RNA測序結合降解組測序，鑒定棉花

2、體細胞胚胎發(fā)生過程中的小RNA及其靶標基因，研究他們在體細胞胚胎發(fā)生過程中的動態(tài)調控，綜合闡述小RNA及其靶標基因在棉花體細胞胚胎發(fā)生中的調控作用;并進一步探討棉花中GhmiR157a及其靶標GhSPL10在棉花脫分化過程中的生物學功能。主要研究結果如下:
　　1、棉花體細胞胚胎發(fā)生相關miRNAs及其靶標基因的挖掘與鑒定
　　本研究構建了YZ1胚性愈傷(EC)和下胚軸(CK，對照)的小RNA測序文庫。發(fā)現36個家族的保守m

3、iRNAs在兩個樣品間差異表達，發(fā)現屬于19個家族的29條保守miRNAs的前體，同時發(fā)現了25個新的miRNAs及其前體。這些miRNAs的長度主要集中在19nt到24 nt之間，21 nt的占了約80％。同時利用降解組測序，在EC中共發(fā)現234個轉錄本被23個保守miRNAs家族成員所剪切，在CK中共發(fā)現322個轉錄本被30個保守miRNAs家族成員所剪切，同時發(fā)現16個轉錄本被8個新的miRNAs所剪切。這些保守靶標中包括轉錄因子

4、、激素信號以及逆境信號相關的基因。此外本研究還發(fā)現4個TAS3轉錄本產生的tasiRNAs及其靶標AFR3/4。5'RACE技術證實大部分保守miRNA能夠誘導它們保守的靶標轉錄本被剪切降解，這說明降解組測序的結果是比較可靠的。miRNA和靶標表達模式分析發(fā)現，miR156及其靶標SPL9，miR169及其靶標NF-YA3和miR396及其靶標GRF8在棉花體細胞胚胎發(fā)生過程中具有明顯的負相關性，據此推測這些miRNAs可能通過負調控相

5、應的靶標進一步調控下游信號路徑，從而參與調控陸地棉體細胞胚胎發(fā)生過程。
　　2、GhmiR157a/GhSPL10參與調控棉花體細胞胚胎發(fā)生過程
　　體細胞胚胎發(fā)生過程中的表達分析發(fā)現GhmiR157a及其靶標GhSPL10在脫分化前期以及胚性再分化過程中均顯示相反的表達趨勢。進一步通過原位雜交發(fā)現GhSPL10在外植體的形成層以及魚雷胚的原維管組織表達，暗示GhmiR157a和 GhSPL10可能通過調控形成層細胞分裂和分

6、化來調控體細胞胚胎發(fā)生過程。通過轉基因手段超表達GhmiR157a和GhSPL10，發(fā)現雖然超表達GhmiR157a沒有明顯表型，但是超表達GhSPL10能夠提高愈傷增殖速率(callus proliferation rate，CPR)，并且導致胚性再分化提前。轉基因系脫分化前期的石蠟切片顯示GhSPL10超表達造成維管束形態(tài)發(fā)生了變化，表現為木質部細胞小而多，且連續(xù)分布;外植體誘導3d以后形成層細胞增多，并且細胞周期相關基因上調表達。

7、這些結果說明GhSPL10超量表達造成了形成層細胞分裂加快，從而提高了脫分化速率。
　　3、GhmiR157a/GhSPL10通過調控乙烯信號路徑和類黃酮生物合成路徑來調控棉花體細胞胚胎發(fā)生
　　為了進一步闡釋超表達GhSPL10脫分化加快的原因，本研究對陰性對照和GhSPL10超量表達株系35S∶rSPL10-7的下胚軸進行RNA-SEQ測序。通過對測序結果分析發(fā)現:1）GhSPL10超表達系與對照相比，有1600多個差異

8、表達的基因，其中1005個上調表達，633個下調表達;2）利用差異表達的基因進行GO和KEGG分析均發(fā)現類黃酮生物合成路徑和植物激素信號路徑顯著富集;3）qRT-PCR驗證了乙烯合成酶基因ACOs以及類黃酮合成相關基因在GhSPL10超表達系中均上調表達;4）類黃酮含量測定發(fā)現GhSPL10超表達系中不同種類的類黃酮與對照相比顯著增加。
　　35S∶rSPL10-7與F3H干涉系Ri3雜交F1代愈傷增殖明顯受抑制，并且在體外添加類

9、黃酮之后恢復至野生型水平。對野生型外植體進行不同種類的類黃酮處理也能夠促進愈傷增殖和細胞周期相關基因的表達。以上結果說明類黃酮在GhSPL10超表達系中的過量積累是造成其愈傷增殖變快的主要原因。
　　4、乙烯信號是導致類黃酮生物合成路徑上調的主要因素之一。
　　用乙烯合成抑制劑AVG處理35S∶rSPL10-7外植體明顯抑制其脫分化，而用乙烯前體ACC處理野生型外植體能夠促進愈傷增殖，用乙烯合成的抑制劑AVG和CoCl2，或

10、者乙烯響應的抑制劑Ag2S2SO3處理則抑制脫分化，說明乙烯信號在GhSPL10超表達系中的上調對愈傷增殖起到正向作用。另外，qRT-PCR的結果顯示，ACC處理能夠進一步激活35S∶rSPL10-7中F3H的相對表達水平，而在rSPL10-7/F3H-Ri3外植體中F3H表達受到明顯抑制，且ACC處理并不能進一步上調其表達水平，說明GhSPL10超表達確實造成了乙烯介導的類黃酮生物合成路徑的變化。另外在脫分化前期，通過ACC處理野生型