海島棉microRNA及其靶標的鑒定和功能分析.pdf

1、microRNA(miRNA)作為一類長度在21-24 nucleotide(nt)的非編碼RNA，在植物的生長發(fā)育，形態(tài)建成，激素信號轉(zhuǎn)導，逆境脅迫響應方面起著重要的作用。目前，miRNA在棉花領(lǐng)域的研究不多，特別是在棉花纖維發(fā)育的功能研究幾乎沒有，而棉花纖維這種單細胞類型是研究細胞伸長和細胞壁合成的良好模型。故我們利用小RNA測序和降解組測序的手段，鑒定了一批在棉花纖維中表達的miRNAs和大量的miRNA靶標基因，并且我們利用轉(zhuǎn)基

2、因手段對miRNA157及其靶標在纖維發(fā)育和調(diào)控花器官大小的功能做了一定的闡述。具體結(jié)果簡述如下:
　　1.纖維發(fā)育相關(guān)microRNAs的挖掘與鑒定
　　我們構(gòu)建了七個纖維發(fā)育文庫，覆蓋纖維的起始，伸長和次生壁加厚期。七個文庫一共檢測到了78萬到209萬條序列，注釋到47個保守miRNA家族，同時預測了34條保守miRNA前體。此外，還鑒定了七個新的候選miRNAs。這些小RNA的長度主要集中在21nt到24nt之間，mi

3、RNA的5'首位堿基更偏好為尿嘧啶。聚類分析和Northern blot的結(jié)果顯示大部分的miRNAs在纖維發(fā)育的不同時期變化非常劇烈。轉(zhuǎn)基因和組織化學染色的方法進一步證明miR156/157，miR165/166和miR172在纖維和胚珠中具有生物活性。
　　2.miRNA靶標基因調(diào)控纖維發(fā)育網(wǎng)絡的挖掘和鑒定
　　利用降解組測序的手段，共有140個保守miRNAs靶標和38個新的候選miRNAs靶標被檢測到。這些保守靶標中

4、有很多是轉(zhuǎn)錄因子，還有一些跟生長素信號，鈣離子信號，雙氧水信號相關(guān)。另外還發(fā)現(xiàn)許多靶標和細胞壁、細胞骨架相關(guān)或者是能量代謝相關(guān)。RLM-RACE技術(shù)也證實了microRNA的確能夠誘導靶標基因轉(zhuǎn)錄本被剪切降解，證明降解組測序的結(jié)果是可靠的。我們挑選了七個感興趣的靶標，分析了靶標和對應miRNAs表達模式的負相關(guān)性，據(jù)此推測Gb-miR156/157，390，399可能通過參與到信號轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)錄調(diào)控來影響纖維發(fā)育，而Gb-miR159，16

5、4，167和nmiR3可能直接調(diào)控細胞骨架的合成、細胞壁的合成與修飾，以及能量代謝來調(diào)控纖維的發(fā)育。
　　3.miRNA157可能正調(diào)控纖維伸長
　　分析野生種和馴化種棉花差異表達基因，發(fā)現(xiàn)miR157的靶標SBP轉(zhuǎn)錄因子表達水平在棉花野生種纖維細胞整體上要高于馴化種，而Gb-miR157相反地在馴化種中表達量更高。通過轉(zhuǎn)基因手段，降低miR157在纖維細胞的活性，可以提高miR157靶標SBP轉(zhuǎn)錄因子的表達量，而轉(zhuǎn)基因材料

6、的纖維長度則變短。由此推測，SBP轉(zhuǎn)錄因子可能抑制纖維細胞的發(fā)育。推測棉花馴化過程中，通過提高miR157的表達量來間接抑制SBP轉(zhuǎn)錄因子，最終達到促進纖維伸長的目的。
　　4.miRNA157參與調(diào)控花器官的發(fā)育
　　Real-time PCR和Northern blot結(jié)果顯示miR157的表達量的確在超量表達miRNA157轉(zhuǎn)基因材料中顯著提高了，但是轉(zhuǎn)基因材料的纖維長度并沒有如預期的變長。轉(zhuǎn)基因材料植株營養(yǎng)生長特別旺

7、盛，葉枝明顯增多，而花器官相反卻明顯變小，子房內(nèi)胚珠數(shù)目明顯減少，導致最終棉桃成熟的種子數(shù)目減少，收獲的單鈴籽棉產(chǎn)量顯著降低。利用RLM-RACE技術(shù)技術(shù)在棉花花蕾中鑒定了miR157的靶標基因，它們是5個SBP-like(SPL)轉(zhuǎn)錄因子。利用RNA sequencing技術(shù)，我們也發(fā)現(xiàn)這5個SPLs基因的表達量在超量表達植株里面下調(diào)表達，進一步證明miRNA157可能通過負調(diào)控這5個SPLs基因來影響花器官的發(fā)育。另外，RNA se