海島棉D(zhuǎn)REB基因克隆及其在轉(zhuǎn)基因煙草中的功能驗證.pdf

1、DREB（干旱響應(yīng)元件結(jié)合蛋白）轉(zhuǎn)錄因子是近十年來新發(fā)現(xiàn)的在植物生長發(fā)育、激素調(diào)節(jié)和抵抗逆境等方面發(fā)揮重要作用的植物特異性轉(zhuǎn)錄因子。在逆境脅迫下，它通過與DRE元件（脫水應(yīng)答元件）特異性結(jié)合，從而激活許多逆境誘導(dǎo)基因的表達，提高植物對逆境的抵抗和忍耐力，使植物的抗逆性得到綜合性改良，是迄今為止最理想的植物抗逆工程基因。
　　 本研究通過同源克隆的方法從海島棉中克隆了一個DREB轉(zhuǎn)錄因子基因，然后將其轉(zhuǎn)入煙草，對它的基本特性進行了

2、研究，證實了這個基因具有DREB類轉(zhuǎn)錄因子的基本特性，它在轉(zhuǎn)基因煙草中的過量表達可以提高煙草抵抗非生物脅迫的能力。主要研究結(jié)果如下：
　　 1.根據(jù)已發(fā)表的陸地棉GhDREB1基因序列設(shè)計特異性引物P1和P2，進行RT-PCR擴增，得到一個長651bp，編碼216個氨基酸的基因，命名為XHDREB。同源性分析表明，XHDREB與陸地GhDREB1，擬南芥CBF1/DREB1B和DREB1A/CBF3在氨基酸水平上的序列相同性分別

3、為85.19%，47.32%和46.64%。
　　 2.分析XHDREB基因編碼的氨基酸序列，其相對分子量為24.6 kDa，等電點為9.46，它具備DREB1轉(zhuǎn)錄因子的特征：含有58個氨基酸組成的AP2 DNA結(jié)合域以及兩個DREB1/CBF特征氨基酸序列PKKRAGRKKFRETR和DSAWR。
　　 3.設(shè)計含有KpnⅠ和PstⅠ酶切位點的特異性引物DR-1和DR-2，用KpnⅠ和PstⅠ分別對XHDREB基因和p

4、CAMBIA2300-35SOCS質(zhì)粒進行雙酶切，用T4 DNA Ligase連接，構(gòu)建植物表達載體pC-XHDREB。
　　 4.利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草，通過Kan抗性、PCR及RT-PCR篩選鑒定陽性煙草。對轉(zhuǎn)基因煙草進行干旱、高鹽等抗逆性分析并且對其相關(guān)生理生化指標進行測定，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因煙草對這些非生物脅迫均有一定的抵抗能力。
　　 3.利用熒光定量RT-PCR對XHDREB在轉(zhuǎn)基因煙草中的表達情況進行分析。結(jié)