播娘蒿DREB1-CBF基因的克隆和表達(dá)及其轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的篩選.pdf

1、四川I大學(xué)碩士學(xué)位論文題目揸蝗莖纓絲迦基固煎盤(pán)隆查盤(pán)墊叢甚掛基因墊壹薟墊掛鮑籃墊作者垡塑蘭完成日期星QQZ生壘旦蘭Q旦指導(dǎo)教師疊垡鏊整撞專業(yè)絲生塑堂研究方向絲生塑僉王生塹堂授予學(xué)位日期生旦旦行研究，為進(jìn)一步從分子水平上解釋耐寒植物與不耐寒植物之間的不同，填補(bǔ)了耐寒植物的抗寒機(jī)制研究的空白打下了基礎(chǔ)，對(duì)進(jìn)一步探索植物的抗逆機(jī)制和培育優(yōu)良的抗寒經(jīng)濟(jì)作物有重要的意義，開(kāi)展研究得到以下成果：一、克隆DsCBFl基因cDNA全長(zhǎng)及DsCBF2基因

2、EST。通過(guò)CLONTECH的5’RACE的方法得到播娘蒿DsCBFl基因的cDNA全長(zhǎng)序列946bp；并結(jié)合其他物種的CBF基因序列進(jìn)行比對(duì)，根據(jù)其同源保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利用同源克隆得到播娘蒿第二條CBF基因640bp大小的EST序列暫時(shí)命名為DsCBF2。二、生物信息學(xué)分析證明所得的DsCBF基因序列屬于CBF基因家族。通過(guò)分析，得到正確完整的CBFl基因ORF框642bp，對(duì)兩條播娘蒿的CBF基因進(jìn)行核酸序列比對(duì)，它們之間具有非

3、常高的同源性，而且其N端的同源性明顯高于C端，推測(cè)它們?cè)诜肿舆M(jìn)化中可能是由一條基因產(chǎn)生。將DsCBFl基因所推演出的蛋白質(zhì)序列和已知物種的DREBl／CBF蛋白比較，發(fā)現(xiàn)它具有DREBl／CBF轉(zhuǎn)錄因子的典型特征。通過(guò)構(gòu)建多個(gè)物種進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)，DsCBFl與AtcBF3親緣關(guān)系更近，推測(cè)其功能與表達(dá)機(jī)制和AtCBFI～3相似。三、研究DsCBF基因在冷脅迫下的mRNA轉(zhuǎn)錄水平差異，證明它們的確受冷脅迫誘導(dǎo)表達(dá)。采用熒光定量PCR的方法，對(duì)

4、播娘蒿的兩條CBF基因進(jìn)行冷脅迫下的差異表達(dá)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在持續(xù)的冷脅迫下，DsCBFl和DsCBF2都被快速誘導(dǎo)，二者的mRNA水平有明顯差異，且在轉(zhuǎn)錄上存在時(shí)間和空間的差異，這可能預(yù)示了二者在抗寒機(jī)制中的優(yōu)秀協(xié)同作用。在常溫下，DsCBFl和DsCBF2基本上沒(méi)有表達(dá)，而且DsCBFl在在溫度下降至10℃時(shí)，轉(zhuǎn)錄水平才有較大的增長(zhǎng)。隨溫度的越低，檢測(cè)到DsCBF的mRNA水平越高；在低溫處理2h后回復(fù)22℃處理30min，其m

5、RNA水平明顯快速下降，這顯示出CBF基因在植物對(duì)抗冷脅迫的途徑中的快速的調(diào)控機(jī)制。該研究?jī)?nèi)容為今后開(kāi)展播娘蒿DsCBF基因家族的功能研究奠定了基礎(chǔ)。四、建立花序轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)基因體系，獲得DsCBFI轉(zhuǎn)基因擬南芥功能驗(yàn)證體系。根據(jù)播娘蒿的DsCBFl基因的ORF序列設(shè)計(jì)引物，克隆得到該基因的ORF全長(zhǎng)，構(gòu)建到植物雙元表達(dá)載體中，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的花序浸染法，將其轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，為今后的進(jìn)一步篩選以及研究DsCBFl的體內(nèi)功能奠定了基礎(chǔ)。關(guān)鍵