擬南芥ros1突變抑制因子的篩選、基因克隆及其功能分析.pdf

1、外源基因插入到植物基因組中會(huì)引起本身或相關(guān)的內(nèi)源基因發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默。這種轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默的過(guò)程通常是由外源基因產(chǎn)生siRNA，再由這些siRNA介導(dǎo)DNA甲基化及組蛋白修飾變化等來(lái)實(shí)現(xiàn)。擬南芥中現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，很多RNAi過(guò)程中的組件、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶以及組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶等參與到這一過(guò)程中。擬南芥中編碼DNA糖基化酶的ROS1基因突變后能夠使多拷貝的轉(zhuǎn)基因ProRD29A：LUC和內(nèi)源RD29A基因的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生超甲基化，從而使內(nèi)源

2、RD29A基因及外源LUC轉(zhuǎn)基因表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默現(xiàn)象，而與其相鄰的轉(zhuǎn)基因Pro35S：NPTⅡ的啟動(dòng)子區(qū)的甲基化雖沒(méi)有發(fā)生變化但卻同樣表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默。ROS1基因作為一種DNA去甲基化酶參與抑制轉(zhuǎn)錄基因沉默過(guò)程中。 利用ros1突變體中沉默的Pro35S：NPTII轉(zhuǎn)基因作為篩選標(biāo)記，我們從EMS誘變的ros1后代中篩選到了一系列ros1突變的抑制因子，其中ror1(suppressorofros1)突變體包括

3、兩個(gè)等位突變，ror1-1和ror1-2。ROR1基因的突變能夠使ros1突變背景中處于沉默狀態(tài)的Pro35S：NPTⅡ 基因恢復(fù)表達(dá)，但是對(duì)ProRD29A：LUC基因的沉默狀態(tài)卻沒(méi)有影響。基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序及擬南芥基因組SouthernBlot分析結(jié)果顯示突變體中RD29A啟動(dòng)子區(qū)整體甲基化情況不受ror1突變的影響，并且基因組中rDNA區(qū)和著絲粒區(qū)的DNA甲基化也不受ror1突變的影響。另外，NorthernBlot分析發(fā)現(xiàn)ro

4、r1ros1突變體中內(nèi)源轉(zhuǎn)座子TSI的表達(dá)量卻比ros1突變體和C24野生型(ros1突變體的背景)都高。 通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因Pro35S:NPTⅡ 的啟動(dòng)子區(qū)的甲基化及組蛋白修飾的分析顯示，雖然C24野生型，ros1突變體及ros1ror1雙突變體中轉(zhuǎn)基因Pro35S：NPTⅡ 的35S啟動(dòng)子區(qū)甲基化情況沒(méi)有變化，但是相對(duì)于ros1突變體，ror1ros1突變體中該區(qū)域組蛋白H3-K9的二甲基化程度降低了，而組蛋白H3的乙?；潭葎t

5、升高了。這說(shuō)明ror1突變引起的轉(zhuǎn)基因Pro35S：NPTⅡ嘔域基因沉默的釋放與DNA甲基化變化無(wú)關(guān)而與組蛋白的修飾狀態(tài)的變化有關(guān)。另外，ror1ros1突變體表現(xiàn)出明顯的發(fā)育上的異常表型，如植株矮小、早花等，一些突變體在發(fā)育晚期還出現(xiàn)末端花結(jié)構(gòu)異常的表型?；蚨ㄎ坏慕Y(jié)果顯示ROR1基因編碼一個(gè)擬南芥DNA復(fù)制蛋白A2(RPA2A，At2g24490)。ROR1/RPA2A基因在根尖及莖尖的分生組織表達(dá)量較高。ROR1/RPA2A基因突

6、變會(huì)影響根尖及莖尖頂端分生組織細(xì)胞的分裂，但是對(duì)細(xì)胞最終的大小沒(méi)有影響。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，ROR1/RPA2A蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，該基因突變后突變體植株對(duì)DNA烷化劑甲基甲磺酸(MMS)超敏感，說(shuō)明ROR1/RPA2A基因在DNA修復(fù)過(guò)程中起重要作用。由于ROS1蛋白也具有DNA修復(fù)的活性，并且酵母雙雜交體外實(shí)驗(yàn)證明了ROR1/RPA2A蛋白與ROS1蛋白的互作關(guān)系，我們推測(cè)ROR1/RPA2A蛋白的DNA修復(fù)功能很可能與ROS1蛋白