兩種庫蚊細(xì)胞凋亡抑制蛋白(IAP)基因及其拮抗因子(Mx)基因的克隆和功能分析.pdf

1、細(xì)胞凋亡是生物體在涉及發(fā)育、維持組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、DNA損傷反應(yīng)、病理學(xué)的過程包括癌癥、局部缺血、神經(jīng)性疾病以及抵御病毒等病原體的感染諸多方面起著關(guān)鍵作用的一個(gè)過程。各項(xiàng)研究已經(jīng)證明IAP拮抗因子-IAP-半胱氨酸蛋白酶途徑是蚊蟲細(xì)胞凋亡重要的信號(hào)通路之一。蚊蟲在全球范圍內(nèi)分布廣泛，是多種流行性疾病的傳播媒介，例如瘧疾、黃熱病、登革熱、各種腦炎等。對(duì)于蚊蟲細(xì)胞凋亡通路的報(bào)道多集中在病毒感染引起的細(xì)胞凋亡以及傳染病等方面，而IAP拮抗因子空

2、間結(jié)構(gòu)以及其與LAP之間相互作用的影響研究還不多見，尤其是三帶喙庫蚊(Culex tritaeriorhynchus)的IAP拮抗因子和LAP分子生物學(xué)方面的研究尚未見報(bào)道。蚊蟲的細(xì)胞凋亡調(diào)控因子的研究將為蚊蟲生物防治提供新的思路，在努力建設(shè)資源節(jié)約型和環(huán)境友好型社會(huì)的今天具有極大的潛在應(yīng)用前景。
　　 本研究運(yùn)用生物信息學(xué)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法分別從三帶喙庫蚊和致倦庫蚊中克隆出iap基因以及iap基因的拮抗基因mx基因。我們

3、從三帶喙庫蚊中克隆得到Ctiap基因，Ctiap全長為1230bp，從致倦庫蚊中克隆得到兩個(gè)iap基因-Cqiap1和Cqiap2，全長分別為1230bp和1518bp，預(yù)測的蛋白CtIAP和CqIAP1均包含有2個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域，1個(gè)RING指結(jié)構(gòu)，全長編碼409個(gè)氨基酸，CqIAP2包含有3個(gè)BIR結(jié)構(gòu)域，1個(gè)RING指結(jié)構(gòu)，全長編碼505個(gè)氨基酸。從兩種庫蚊中克隆到的iap基因的拮抗基因mx基因-Ctmx及Cqmx全長均為312bp

4、，編碼103個(gè)氨基酸，CtMx和CqMx預(yù)測的蛋白序列均和已發(fā)表的致倦庫蚊Mx蛋白序列(Gene ID：6034303)相似性很高，CtMx與其相似度為96％，有四個(gè)氨基酸不同，CqMx與其相似性為97％，有三個(gè)氨基酸的差異。這兩種蚊蟲基因組中的Mx蛋白均包含有一個(gè)不變的N-末端IBM基序，這和果蠅的Grim蛋白幾乎是相同的，但I(xiàn)BM基序之外的序列比對(duì)顯示基本沒有同一性。
　　 為了研究IAP及其拮抗因子的功能以及它們之間的相互

5、作用，我們將我們克隆得到的IAP及其拮抗因子Mx轉(zhuǎn)染到白紋伊蚊C6/36細(xì)胞中，用MTT法檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)克隆的兩個(gè)mx均能夠?qū)е旅黠@的細(xì)胞死亡，和發(fā)表的埃及伊蚊mx基因功能吻合，本文研究的iap基因在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)內(nèi)對(duì)細(xì)胞存活率無明顯影響。同時(shí)將三帶喙庫蚊的mx和iap質(zhì)粒分別以1:1，1:3，1:5和1:7的比例混合轉(zhuǎn)染C6/36細(xì)胞，結(jié)果顯示從1:1到1:3的比例轉(zhuǎn)染，細(xì)胞存活率呈升高趨勢，且以1:3，1:5和1:7

6、的比例轉(zhuǎn)染結(jié)果和與空載體的轉(zhuǎn)染結(jié)果無顯著性差異，說明IAP能夠完全阻斷Mx誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步研究Mx的生物活性機(jī)制，我們應(yīng)用相關(guān)軟件預(yù)測了Mx的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示Mx全長除含有和果蠅IAP拮抗因子一樣的N末端的7個(gè)氨基酸的保守區(qū)域(IBM)外，還含有3個(gè)α螺旋。我們分別將不包含α螺旋、包含一個(gè)α螺旋、包含兩個(gè)α螺旋的Ctmx片段克隆出來，將相關(guān)基因以及包含不同α螺旋數(shù)目的片段轉(zhuǎn)染進(jìn)白紋伊蚊C6/36細(xì)胞，結(jié)果表明包含有一個(gè)α螺旋