蘋(píng)果兩個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆與功能分析.pdf

1、長(zhǎng)期以來(lái)，利用傳統(tǒng)的育種手段對(duì)多年生木本果樹(shù)進(jìn)行遺傳改良時(shí)，由于受到童期較長(zhǎng)等因素的影響，育種進(jìn)程較為緩慢?；蚬こ碳夹g(shù)的迅猛發(fā)展使其成為育種的一種重要的有巨大發(fā)展?jié)摿Φ氖侄危珊?、鹽害、極端溫度、化學(xué)毒害和氧化脅迫等非生物脅迫嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，并導(dǎo)致環(huán)境退化．植物在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，需要對(duì)各種逆境信號(hào)作出反應(yīng)，這就要求對(duì)各種功能基因的表達(dá)進(jìn)行精確調(diào)控。因此，系統(tǒng)研究植物對(duì)環(huán)境脅迫應(yīng)答的機(jī)制就顯得尤為重要．近年來(lái)模式植物的研究為果樹(shù)抗逆的

2、研究提供了難得的機(jī)遇。蘋(píng)果是世界上最重要的果樹(shù)之一，由于其生態(tài)適應(yīng)性較強(qiáng)，果品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，耐貯性好，供應(yīng)周期長(zhǎng)，世界上許多國(guó)家都將其列為主要消費(fèi)果品而大力推薦，然而，在果樹(shù)的栽培過(guò)程中，經(jīng)常會(huì)遭遇不同程度的逆境脅迫，而且近年來(lái)，全球環(huán)境變化加劇，惡劣天氣頻出，這對(duì)蘋(píng)果的品質(zhì)和產(chǎn)量都造成很大的影響，在蘋(píng)果的生產(chǎn)中，為提高其抗逆境脅迫的能力，研究蘋(píng)果各種抗逆基因迫在眉睫。
　　 本文對(duì)兩個(gè)蘋(píng)果中MYB基因通過(guò)擬南芥驗(yàn)證了其功能，以期

3、為利用這些基因進(jìn)行蘋(píng)果或其它果樹(shù)的基因工程改良或表達(dá)調(diào)控提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下：
　　 1．利用PCR方法方法合成了來(lái)源于蘋(píng)果的轉(zhuǎn)錄因子MdMYB6。使用Real-TimePCR技術(shù)對(duì)MdMYB6基因在不同組織以及不同逆境脅迫下的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了定量分析，結(jié)果表明，MdMYB6基因的表達(dá)在根中最高，并且受蔗糖、PEG的誘導(dǎo)．
　　 2．分析了MdMYB6基因的序列，序列分析表明MdMYB6的開(kāi)放閱讀框(ORF)

4、為939bp，編碼一個(gè)由312個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。進(jìn)化樹(shù)分析推測(cè)其基因功能可能與蔗糖響應(yīng)有關(guān)。并利用模式植物擬南芥研究了MdMYB6的功能，在蔗糖澆灌實(shí)驗(yàn)中，野生型擬南芥葉片全部變紅，而轉(zhuǎn)基因擬南芥則基本沒(méi)有變化．進(jìn)一步測(cè)定擬南芥花青素含量以及花青素生物合成基因，結(jié)果表明，MdMYB6基因能夠抑制轉(zhuǎn)基因擬南芥中花青素的生物合成，并且花青素生物合成基因CHS、CHI。DFR、UF3GT,LDOX和FLS也受到MdMYB6基因的抑制，花青

5、素合成調(diào)控基因PAP1、PAP2也受到了抑制。同時(shí)，我們還又測(cè)定了轉(zhuǎn)MdMYB6基因的擬南芥中蔗糖響應(yīng)和蔗糖運(yùn)輸相關(guān)基因，結(jié)果表明，MdMYB6改變了蔗糖合成酶基因AtSUS1，蔗糖運(yùn)輸酶AtSUC1，AtSUC2和AtSUC3表達(dá)，同時(shí)與糖信號(hào)相關(guān)的UGPase、AtHXK1也發(fā)生了改變。
　　 3．利用基于PCR的PTDS（PCR-based two-step DNA synthesis，PTDS）方法合成了來(lái)源于蘋(píng)果的轉(zhuǎn)錄

6、因子MdMYB10基因并利用模式植物擬南芥研究了這個(gè)基因的功能．分析其在山梨醇滲透脅迫條件下的功能表明，在山梨醇脅迫條件下，過(guò)量表達(dá)MdMYB10基因的擬南芥存活率較野生型顯著提高，通過(guò)測(cè)定一系列生理指標(biāo)，進(jìn)一步證明了MdMYB10基因能夠在脅迫條件下降低葉綠素的降解，同時(shí)提高了類(lèi)黃酮，脯氨酸的表達(dá)，避免了細(xì)胞膜的破壞，從而使轉(zhuǎn)基因擬南芥提高了對(duì)滲透脅迫的耐受性．隨后的RT-PCR證明了在滲透脅迫下，MdMYB10基因能夠促進(jìn)類(lèi)黃酮合成