棕色棉色素相關(guān)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及功能研究.pdf

1、本研究以近等基因系白色棉品種RT白絮和棕色棉品種棕1-61為材料，從形態(tài)學(xué)方面對纖維分化發(fā)育和色素沉積分布進(jìn)行了研究;利用熒光定量PCR技術(shù)分析了類黃酮合成途徑中結(jié)構(gòu)基因及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在不同組織中的表達(dá)模式;通過酵母單雜交技術(shù)驗(yàn)證MYB轉(zhuǎn)錄因子基因與類黃酮合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的關(guān)系;通過胚珠離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分析MeJA對類黃酮合成途徑中結(jié)構(gòu)基因及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的影響;通過田間噴施MeJA分析MeJA對棉纖維色差及纖維品質(zhì)的影響。本研究主

2、要結(jié)論如下:
　　1.比較RT白絮和棕1-61棉纖維分化發(fā)育規(guī)律
　　棕1-61胚珠表皮細(xì)胞突起較早，且發(fā)育較快，纖維分化發(fā)育早于RT白絮;棕1-61從10dpa開始已經(jīng)在棉纖維細(xì)胞壁邊緣形成染色較深的黑色致密物質(zhì)，并隨著次生壁加厚，細(xì)胞脫水，黑色致密物質(zhì)逐漸靠近纖維細(xì)胞中腔，并最終沉積于纖維細(xì)胞中腔。推測該黑色致密物有可能就是棕色棉棉纖維中的色素。
　　2.分析棕色棉不同組織類黃酮合成途徑中結(jié)構(gòu)基因及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表

3、達(dá)水平
　　類黃酮合成途徑中的結(jié)構(gòu)基因在棕1-61和RT白絮中均無組織特異性表達(dá)。Gh UFGT基因與其他結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)模式不同，它在棕1-61花后25天和30天仍大量表達(dá)，且表達(dá)量極顯著高于RT白絮;本試驗(yàn)還篩選出可能對棕色棉纖維色素合成起正調(diào)控作用的MYB家族基因成員GhTT2、起負(fù)調(diào)控作用的GhMYB1和GhMYB6。
　　3.MYB家族基因成員GhTT2、GhMYB1和GhMYB6的克隆
　　分別從白色棉RT白

4、絮和棕色棉棕1-61中克隆出MYB家族基因成員GhTT2、GhMYB1和GhMYB6，對比序列，發(fā)現(xiàn)序列無差異，由此推測棕色棉棕1-61具有顏色可能是由這三個(gè)基因的表達(dá)調(diào)控作用而非其序列發(fā)生突變引起。
　　4.酵母單雜交驗(yàn)證MYB轉(zhuǎn)錄因子基因與類黃酮合成途徑中結(jié)構(gòu)基因的關(guān)系
　　通過對MYB家族基因成員GhTT2、GhMYB1和GhMYB6和類黃酮合成途徑中的后期結(jié)構(gòu)基因GhDFR、GhANS、GhANR和Gh UFGT的兩

5、兩點(diǎn)對點(diǎn)酵母單雜交驗(yàn)證發(fā)現(xiàn):GhMYB1與GhANS有互作，GhMYB6與GhUFGT有互作。據(jù)此推測GhMYB1和GhMYB6可能分別調(diào)控GhANS和GhUFGT的表達(dá)，進(jìn)而影響棕色棉纖維色素的合成。
　　5.GhMYB1和GhMYB6的亞細(xì)胞定位
　　通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方式對基因hMYB1和GhMYB6在煙草細(xì)胞中進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，GhMYB1和GhMYB6基因編碼的蛋白均定位在細(xì)胞核中。說明基因GhMYB1和Gh

6、MYB6在細(xì)胞核中發(fā)揮調(diào)控作用。
　　6.棕色棉胚珠離體培養(yǎng)
　　1.在濃度為40.0μmol·L-1的MeJA處理下進(jìn)行棕色棉胚珠離體培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，并對類黃酮合成途徑中結(jié)構(gòu)基因及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在MeJA處理前后RT白絮和棕1-61不同發(fā)育時(shí)期棉纖維的表達(dá)情況進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn):結(jié)構(gòu)基因中表達(dá)量變化最大的是Gh UFGT基因，在兩個(gè)品種中表達(dá)量均呈現(xiàn)百倍增加趨勢;轉(zhuǎn)錄因子中表達(dá)量變化最大的GhMYB6基因在兩品種中表達(dá)量也呈增加趨勢，且

7、在棕色棉30DPC時(shí)增加最多，約15倍。結(jié)合之前酵母單雜交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測GhMYB6在調(diào)控GhUFGT的表達(dá)時(shí)，受茉莉酸甲酯誘導(dǎo)，導(dǎo)致GhUFGT基因表達(dá)量的變化幅度較大。
　　7.對田間棕色棉噴施MeJA
　　在40μmol L-1MeJA田間處理時(shí)，RT白絮棉纖維的色差ΔE*ab達(dá)到最大值，而棕1-61色差ΔE*ab則在400μmol L-1MeJA處理時(shí)才達(dá)到最大值;MeJA處理會降低RT白絮的纖維品質(zhì)而提高棕1-61