參與柿單寧代謝的MYB、bHLH及WD40轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及分析.pdf

1、柿(Diospyros kaki Thunb.)原產(chǎn)于中國，栽培面積和產(chǎn)量均居世界第一，但傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)多為澀柿，人工脫澀處理耗費(fèi)大量人力、物力和財(cái)力。柿果呈現(xiàn)澀感是因其果肉中單寧細(xì)胞的液胞內(nèi)含有大量的原花青素(Proanthocyanidins，PAs；也稱縮合單寧，condensed tannin)之故。單寧作為類黃酮代謝途徑的終產(chǎn)物之一，其生成途徑有眾多結(jié)構(gòu)基因參與，而結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)又受轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。已有研究表明，MYB、basic H

2、elix-Loop-Helix(bHLH)和WD40三類轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成MBW復(fù)合體，共同調(diào)控單寧的代謝途徑。但中國原產(chǎn)完全甜柿自然脫澀是否與上述轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)目前尚不清楚。本研究以中國原產(chǎn)完全甜柿‘羅田甜柿’為主要研究試材，分離克隆了MYB、bHLH和WD40三類轉(zhuǎn)錄因子，開展了柿單寧代謝調(diào)控相關(guān)研究工作。具體研究結(jié)果如下。
　　 1.發(fā)育期柿果實(shí)單寧含量測定。在花后5周，供試材料中單位果重內(nèi)可溶性與不溶性單寧含量均最高，并隨果實(shí)發(fā)

3、育而逐漸減少，到花后13周，‘前川次郎’(日本原產(chǎn)完全甜柿)和‘西村早生’(日本原產(chǎn)不完全甜柿)果實(shí)已完成脫澀，而‘羅田甜柿’(中國原產(chǎn)完全甜柿)果實(shí)在花后21周后脫澀，‘磨盤柿’(中國原產(chǎn)完全澀柿)不能在樹上完成脫澀?！按ù卫伞汀鞔逶缟瘑喂膯螌幒吭诠麑?shí)發(fā)育早期停止增長，而‘羅田甜柿’和‘磨盤柿’的單寧累積持續(xù)到果實(shí)發(fā)育后期。
　　 2.‘羅田甜柿’乙醇脫澀處理后單寧含量變化?；ê?7周，對‘羅田甜柿’進(jìn)行離體35%

4、乙醇脫澀處理，處理兩天后，果實(shí)脫澀，可以觀察到單寧細(xì)胞顏色明顯加深，果實(shí)中可溶性單寧含量顯著減少，同時(shí)不溶性單寧含量相應(yīng)增加，可溶性單寧轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄詥螌帲麑?shí)通過“凝固效應(yīng)”而脫澀。
　　 3.柿MYB基因克隆及分析。以擬南芥和葡萄MYB轉(zhuǎn)錄因子序列為信息探針，在柿EST數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析，找到一個(gè)候選片段DC587740，隨后在‘羅田甜柿’中擴(kuò)增出其片段，通過3'RACE和5'Hi-TAIL PCR擴(kuò)增得到其全長序列1

5、152bp，其中ORF長843bp，編碼280個(gè)氨基酸，將該基因命名為DkPA1，序列已提交GenBank。DkPA1具有MYB轉(zhuǎn)錄因子的典型結(jié)構(gòu)域，屬于R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子，通過鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)其與已報(bào)道的其他物種中參與單寧調(diào)控MYB轉(zhuǎn)錄因子具有極高的序列相似性。DkPA1在‘羅田甜柿’與‘磨盤柿’中的表達(dá)模式與兩個(gè)材料中單寧的累積模式一致，與結(jié)構(gòu)基因DkDHD、DkSCPL、DkF3'H、DkF3'5'H、DkANR的表達(dá)

6、模式也一致。
　　 4.柿bHLH基因克隆及分析。以擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子AtTT8為信息探針，檢索柿EST數(shù)據(jù)庫，找到一個(gè)候選片段DC587220，在‘羅田甜柿’中擴(kuò)增出其片段，通過3'RACE和5'Hi-TAIL PCR擴(kuò)增得到其全長序列2687bp，ORF長2160bp，編碼719個(gè)氨基酸，將該基因命名為DkMYC1，序列已提交GenBank。DkMYC1具有bHLH家族典型的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)，屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子Ⅲ

7、f家族成員，與葡萄和擬南芥中參與單寧代謝調(diào)控的bHLH轉(zhuǎn)錄因子具有極高的序列相似性。在‘羅田甜柿’、‘前川次郎’和‘磨盤柿’中，DkMYC1的表達(dá)模式與三個(gè)材料中單寧的累積模式一致，也與DkANR、DkF3'5'H等結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)模式一致。在‘羅田甜柿’中分離得到單寧代謝途徑兩個(gè)特異基因DkLAR和DkANR啟動(dòng)子序列，發(fā)現(xiàn)在DkANR的啟動(dòng)子區(qū)具有多個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵調(diào)控元件MYCATERD1及MYCCONSENSUSAT，進(jìn)一

8、步確定其受DkMYC1調(diào)控。
　　 5.柿WD40基因克隆及分析。通過同源克隆法設(shè)計(jì)簡并引物，在‘羅田甜柿’中擴(kuò)增出WD40基因片段，通過3'RACE和5'Hi-TAIL PCR擴(kuò)增到全長序列1640bp，ORF全長1014bp，編碼337個(gè)氨基酸，將該基因命名為DkWD40，序列已提交GenBank。DkWD40具有4個(gè)典型WD40結(jié)構(gòu)域，與葡萄VvWDR1相似性最高。在發(fā)育期的果實(shí)中，DkWD40的表達(dá)與單寧代謝途徑中結(jié)構(gòu)基

9、因(DkDHD、DkSCPL、DkF3'H、DkF3'5'H、DkANR)的表達(dá)并不十分相符，而與單寧凝固基因(DkADH1)相符。在乙醇脫澀處理果實(shí)中，DkWD40也與單寧凝固基因表達(dá)一致。將DkWD40構(gòu)建超表達(dá)載體打入農(nóng)桿菌，并侵染擬南芥花序，轉(zhuǎn)基因后的擬南芥種皮顏色為黑褐色。
　　 6.組織特異性表達(dá)分析。DkPA1、DkMYC1和DkWD40在四種供試材料莖、葉、花、萼片、果皮、果肉和種子中均有表達(dá)，并非果實(shí)特異表達(dá)基

10、因，在不同品種的不同部位，其豐度不同，在完全澀柿中表達(dá)量高于完全甜柿，且在幼嫩的葉和萼片中表達(dá)量較高，在果實(shí)中的表達(dá)量高低與果實(shí)中單寧含量成正相關(guān)。
　　 7.‘華柿1號(hào)’種質(zhì)鑒定。通過測定‘華柿1號(hào)’果實(shí)單寧含量及單寧細(xì)胞大小，觀察與統(tǒng)計(jì)果實(shí)及種子情況，結(jié)合RAPD和ISSR等多種分子標(biāo)記鑒定結(jié)果，推測‘華柿1號(hào)’是一個(gè)起源于日本的不完全澀柿種質(zhì)，其在柿的遺傳改良中可能具有重要價(jià)值。
　　 本研究從中國原產(chǎn)完全甜柿‘羅