茶樹(shù)兩個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、在植物體內(nèi)，苯丙烷代謝是一條重要的次生代謝，涉及到木質(zhì)素、香豆酸酯類(lèi)以及類(lèi)黃酮等多種代謝產(chǎn)物的生成[1]。MYB轉(zhuǎn)錄因子，是植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，參與調(diào)控苯丙烷類(lèi)代謝途徑。
　　本研究克隆并分析了2個(gè)茶樹(shù)中的第四亞組R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子；利用qRT-PCR技術(shù)，分析了它們?cè)诓煌鞴俨煌幚硐碌幕虮磉_(dá)特異性；為探討它們對(duì)植物酚類(lèi)物質(zhì)合成代謝的調(diào)控作用，構(gòu)建了真核表達(dá)載體，進(jìn)行煙草和擬南芥的轉(zhuǎn)化。
　　主要研究結(jié)果

2、如下：
　　1．首先利用同源克隆的方法，從 NCBI和安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組篩選出可能涉及苯丙烷代謝途徑調(diào)控的候選R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的EST序列。利用RACE技術(shù)，克隆并得到茶樹(shù)兩條候選R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的cDNA全長(zhǎng)。
　　2．利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，這兩條 R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子位于22個(gè)植物R2R3-MYB亞組中的第四亞組（C2阻遏物基因序列進(jìn)化枝），分別命名為CsMYB4-5與CsMYB4-6，預(yù)測(cè)具有

3、抑制酚類(lèi)物質(zhì)合成的調(diào)節(jié)功能。利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)CsMYB4-5氨基酸序列與金魚(yú)草AmMYB330和擬南芥AtMYB3一致性分別為48.45％和44.79%；CsMYB4-6氨基酸序列與金魚(yú)草AmMYB308和擬南芥AtMYB4一致性分別為69.80%和62.41%。
　　3．利用qRT-PCR技術(shù)，分別檢測(cè)了兩個(gè)基因在茶樹(shù)的不同器官、不同的誘導(dǎo)條件、葉片不同的發(fā)育時(shí)期的表達(dá)差異。結(jié)果表明，CsMYB4-5

4、和CsMYB4-6兩個(gè)基因在根中表達(dá)量高，莖中表達(dá)量低；但是隨著葉片伸展發(fā)育，兩個(gè)基因的表達(dá)趨勢(shì)并不完全相同；傷害處理、外源植物激素ABA和GA對(duì)CsMYB4-5與CsMYB4-6表達(dá)的影響并不大。
　　4．利用煙草遺傳轉(zhuǎn)化體系驗(yàn)證CsMYB4-5與CsMYB4-6轉(zhuǎn)錄因子的功能，結(jié)果顯示，與野生型煙草相比較，轉(zhuǎn)CsMYB4-5和CsMYB4-6轉(zhuǎn)錄因子煙草的生長(zhǎng)均受到不同程度的阻礙，其中轉(zhuǎn)CsMYB4-6轉(zhuǎn)錄因子對(duì)煙草生長(zhǎng)的抑制

5、更加明顯。
　　不同轉(zhuǎn)CsMYB4-6基因的煙草株系，隨著CsMYB4-6轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平的增加表型更顯著。轉(zhuǎn)CsMYB4-6轉(zhuǎn)錄因子煙草的表型表現(xiàn)在：植物矮??；葉片的葉脈緊縮而脈間凹凸不平，在成熟及衰老葉片上出現(xiàn)白色斑點(diǎn)（孤立的死細(xì)胞）；根系不發(fā)達(dá)，主根不明顯；低表達(dá)的煙草株系其花色加深，而高表達(dá)的花色變淺。
　　再生過(guò)程中，轉(zhuǎn)CsMYB4-6煙草愈傷發(fā)黃，長(zhǎng)勢(shì)明顯低于野生型；第二代種子播種得到的煙草小苗相比于野生型二代小

6、苗明顯矮小、黃化、根系短。
　　顯微觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)CsMYB4-6煙草葉片腺毛明顯變短，數(shù)量減少；葉片上下表皮之間細(xì)胞聯(lián)系不緊密，出現(xiàn)空隙；間苯三酚染色觀察，莖橫切面紅色變淡，表明木質(zhì)素含量減少。
　　酚類(lèi)物質(zhì)含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn) CsMYB4-6煙草葉片的木質(zhì)素含量比對(duì)照下降了36.1%-44.4%，纖維素減少多達(dá)15.1%；高表達(dá)煙草株系的花中花青素含量下降47.7%，而低表達(dá)煙草株系花青素升高38.3%。
　　實(shí)時(shí)熒光

7、定量PCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)CsMYB4-6煙草葉片中涉及木質(zhì)素生物合成途徑的COMT、CCR、CAD、C4H、4CL基因表達(dá)下調(diào)，其中4CL基因下調(diào)幅度最大；在高表達(dá)轉(zhuǎn)CsMYB4-6煙草花中涉及類(lèi)黃酮生物合成途徑中的PAL、C4H、CHS、CHI、DFR、LAR、ANR、ANS基因均下調(diào)，而在低表達(dá)煙草株系的花中卻都上調(diào)。
　　5.利用擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化體系驗(yàn)證CsMYB4-5與CsMYB4-6轉(zhuǎn)錄因子的功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在6-8葉幼