棉花兩個(gè)MYB基因的克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、棉纖維發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，MYB轉(zhuǎn)錄因子在其中可能起著重要的調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)室曾以陸地棉徐州142(Xu142)、蘇研401、7235和CJ139以及徐州142無纖維突變體(fl）為材料，比較了開花當(dāng)天和開花后1 day post anthesis(DPA)胚殊的基因表達(dá)譜差異，其中有兩個(gè)MYB基因在所有正常棉花纖維中大量表達(dá)，而在fl中顯著下調(diào)表達(dá)，推測它們可能在纖維發(fā)育過程中起著重要作用。本研究從陸地棉徐州142中克隆到了這

2、兩個(gè)MYB基因，并對其功能進(jìn)行了初步研究。具體結(jié)果如下:
　　1.采用RACE技術(shù)克隆了這兩個(gè)MYB基因的cDNA全長，其中一個(gè)MYB蛋白質(zhì)序列與擬南芥AtMYB60相似度為58％，故將其暫命名為GhMYB60。GhMYB60cDNA全長共1052bp，共編碼297個(gè)氨基酸。亞細(xì)胞定位顯示GhMYB60蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，這說明該基因是一個(gè)在核內(nèi)起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子。采用exonerate軟件分析結(jié)果顯示GhMYB60位于D亞

3、組第13條染色體上，其基因組序列中包含2個(gè)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。
　　2.另一個(gè)MYB蛋白分別與棉花GhMYB25及GhMYB25-like相似度為81％及62％，故將其暫命名為GhMYB25-1。GhMYB25-1 cDNA全長共1226bp，共編碼332個(gè)氨基酸。亞細(xì)胞定位顯示GhMYB25-1蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，這說明該基因也是一個(gè)在核內(nèi)起轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子。采用exonerate軟件分析結(jié)果顯示GhMYB25-1位于D亞組第13

4、條染色體上，其基因組序列中包含2個(gè)內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，同時(shí)GhMYB25及GhMYB25-like則分別位于D亞組第12及第8條染色體上，這表明GhMYB25-1雖然與GhMYB25及GhMYB25-like相似性較高，但其在棉花中并未被克隆過，是一個(gè)新的基因。
　　3.采用qRT-PCR技術(shù)，對GhMYB60和GhMYB5-1在Xu142和fl的時(shí)空表達(dá)特征進(jìn)行了分析。結(jié)果表明:GhMYB60在Xu142以及fl的根、莖、葉、-3 DP

5、A、0 DPA和3 DPA的胚珠，Xu142的6 DPA、10 DPA、15 DPA和20 DPA的纖維以及fl的6 DPA、10 DPA、15 DPA和20 DPA的胚珠中都有表達(dá)，其中在Xu142的葉片、0 DPA及3 DPA的胚殊中顯著高表達(dá)于fl;從6 DPA開始，在Xu142的纖維中GhMYB60都處于一個(gè)較高的表達(dá)水平，但其表達(dá)量一直下降，而在fl的胚珠中，該基因表達(dá)量持續(xù)上升。這說明GhMYB60可能在棉花纖維發(fā)育過程中起

6、作用。
　　4.除了在野生型棉花Xu142的0 DPA胚珠中顯著高表達(dá)于fl之外，GhMYB25-1在 Xu142以及fl的根、莖、葉、-3 DPA、0DPA和3 DPA的胚珠，Xu142的6DPA、10 DPA、15 DPA和20 DPA的纖維以及fl的6 DPA、10 DPA、15 DPA和20 DPA的胚珠中的表達(dá)量并無明顯差異，從3 DPA開始，無論是在野生型Xu142還是fl突變體中，該基因的表達(dá)水平一直上升，直到15

7、DPA趨于平穩(wěn)，并且其表達(dá)量都處于一個(gè)較高水平。這一結(jié)果表明GhMYB25-1有可能在纖維突起形成過程中起著重要的作用。
　　5.分別構(gòu)建GhMYB60及GhMYB25-1基因的植物過表達(dá)載體，通過泡花法將它們導(dǎo)入到Col-0型擬南芥中，并成功獲得了轉(zhuǎn)基因擬南芥陽性苗。通過觀察GhMYB60轉(zhuǎn)基因T1、T2代擬南芥表型，以及部分功能性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GhMYB60促進(jìn)根系發(fā)育，使得轉(zhuǎn)基因擬南芥的初花期提前大約兩周左右，此外植物激素脫落酸