棉花兩個MYB基因的克隆及功能驗證.pdf

1、棉纖維發(fā)育是一個復雜的生物學過程，MYB轉錄因子在其中可能起著重要的調控作用。本實驗室曾以陸地棉徐州142(Xu142)、蘇研401、7235和CJ139以及徐州142無纖維突變體(fl）為材料，比較了開花當天和開花后1 day post anthesis(DPA)胚殊的基因表達譜差異，其中有兩個MYB基因在所有正常棉花纖維中大量表達，而在fl中顯著下調表達，推測它們可能在纖維發(fā)育過程中起著重要作用。本研究從陸地棉徐州142中克隆到了這

2、兩個MYB基因，并對其功能進行了初步研究。具體結果如下:
　　1.采用RACE技術克隆了這兩個MYB基因的cDNA全長，其中一個MYB蛋白質序列與擬南芥AtMYB60相似度為58％，故將其暫命名為GhMYB60。GhMYB60cDNA全長共1052bp，共編碼297個氨基酸。亞細胞定位顯示GhMYB60蛋白定位于細胞核內，這說明該基因是一個在核內起轉錄調控作用的轉錄因子。采用exonerate軟件分析結果顯示GhMYB60位于D亞

3、組第13條染色體上，其基因組序列中包含2個內含子結構。
　　2.另一個MYB蛋白分別與棉花GhMYB25及GhMYB25-like相似度為81％及62％，故將其暫命名為GhMYB25-1。GhMYB25-1 cDNA全長共1226bp，共編碼332個氨基酸。亞細胞定位顯示GhMYB25-1蛋白定位于細胞核內，這說明該基因也是一個在核內起轉錄調控作用的轉錄因子。采用exonerate軟件分析結果顯示GhMYB25-1位于D亞組第13

4、條染色體上，其基因組序列中包含2個內含子結構，同時GhMYB25及GhMYB25-like則分別位于D亞組第12及第8條染色體上，這表明GhMYB25-1雖然與GhMYB25及GhMYB25-like相似性較高，但其在棉花中并未被克隆過，是一個新的基因。
　　3.采用qRT-PCR技術，對GhMYB60和GhMYB5-1在Xu142和fl的時空表達特征進行了分析。結果表明:GhMYB60在Xu142以及fl的根、莖、葉、-3 DP

5、A、0 DPA和3 DPA的胚珠，Xu142的6 DPA、10 DPA、15 DPA和20 DPA的纖維以及fl的6 DPA、10 DPA、15 DPA和20 DPA的胚珠中都有表達，其中在Xu142的葉片、0 DPA及3 DPA的胚殊中顯著高表達于fl;從6 DPA開始，在Xu142的纖維中GhMYB60都處于一個較高的表達水平，但其表達量一直下降，而在fl的胚珠中，該基因表達量持續(xù)上升。這說明GhMYB60可能在棉花纖維發(fā)育過程中起

6、作用。
　　4.除了在野生型棉花Xu142的0 DPA胚珠中顯著高表達于fl之外，GhMYB25-1在 Xu142以及fl的根、莖、葉、-3 DPA、0DPA和3 DPA的胚珠，Xu142的6DPA、10 DPA、15 DPA和20 DPA的纖維以及fl的6 DPA、10 DPA、15 DPA和20 DPA的胚珠中的表達量并無明顯差異，從3 DPA開始，無論是在野生型Xu142還是fl突變體中，該基因的表達水平一直上升，直到15

7、DPA趨于平穩(wěn)，并且其表達量都處于一個較高水平。這一結果表明GhMYB25-1有可能在纖維突起形成過程中起著重要的作用。
　　5.分別構建GhMYB60及GhMYB25-1基因的植物過表達載體，通過泡花法將它們導入到Col-0型擬南芥中，并成功獲得了轉基因擬南芥陽性苗。通過觀察GhMYB60轉基因T1、T2代擬南芥表型，以及部分功能性實驗發(fā)現，GhMYB60促進根系發(fā)育，使得轉基因擬南芥的初花期提前大約兩周左右，此外植物激素脫落酸