桉樹木質素合成途徑兩個關鍵基因的克隆與功能研究.pdf

1、桉樹是世界上第二大人工造林樹種,桉樹木材亦是我國南方重要的造紙材料。木質素是植物中具有重要生物功能的次生代謝產物,是世界上第二位豐富的有機物,然而,紙漿生產中須將桉木原料中的木質素與用于造紙的纖維素分離,產生了大量的造紙廢液,嚴重污染環(huán)境,并且增加造紙成本。培育低木質素的造紙植物新品種并推廣應用正日益受到各國的高度重視,而通過RNAi轉基因技術是實現低木質素育種的最快最優(yōu)途徑,亦是從源頭上降低植物木質素含量的最有效辦法。因而,克隆桉樹木

2、質素合成調控關鍵基因是對桉樹進行木質素基因工程改良的基礎,具有重大意義。本論文主要研究結果如下:
　　 1.桉樹CAD和4CL基因的全長克隆。以赤桉葉片和莖為材料,分別提取DNA和RNA,并將DNA與RNA反轉錄的cDNA作為模板,根據桉樹其它物種的CAD和4CL基因的核苷酸序列保守區(qū)域,利用專業(yè)軟件PrimerPremier5.0設計引物,通過PCR及RT-PCR技術擴增出兩個基因的DNA片段和cDNA片段,將產物克隆至pMD

3、18-T載體,轉化大腸桿菌DH5α菌株,并進行測序驗證。
　　 2.赤桉CAD和4CL基因的生物信息學分析。通過生物信息學軟件Vector NTI9.0對測序結果進行分析:CAD全長基因組序列為2304 bp,cDNA長1102 bp,含有一個1068 bp的編碼框,編碼356個氨基酸殘基；4CL全長基因組序列為5481 bp,cDNA序列1670 bp,含有一個1632 bp的編碼框,編碼544個氨基酸殘基。通過GenBank

4、上的序列比對,結果表明該序列與其它物種的CAD和4CL基因的一致性達到97％以上,可確認此序列是赤桉的CAD和4CL基因的全長序列。將兩個基因的基因組與cDNA序列分別進行比對,發(fā)現兩個基因都有5個外顯子,4個內含子。應用蛋白質分析軟件對這兩個cDNA序列推導的蛋白質序列的理化性質、二級結構、三級結構等進行分析與預測。結果顯示:CAD蛋白的等電點為5.705,分子量為38.775KDa；3個跨膜結構域,有一個信號肰剪切位點,且此蛋白是一

5、個親水蛋白,富含α螺旋和β折疊。4CL蛋白等電點為5.095,分子量為59.332KDa,存在4個跨膜區(qū)域,有一個信號肰剪切位點,該蛋白二級結構主要以α螺旋為主,并在其氨基酸序列上存在兩大絕對保守域,即SSGTTGLPKGV和GEICIRG,其中SSGTTGLPKGV被認為是4CL催化反應中保守的AMP結合功能域。
　　 3.赤桉CAD和4CL基因的原核融合表達。設計了兩對特異表達引物,分別選用限制性內切酶BamHⅠ和SalⅠ、