野生豆科牧草歪頭菜再生體系構(gòu)建及木質(zhì)素合成相關(guān)基因片段克隆.pdf

1、歪頭菜是一種優(yōu)良的豆科牧草，營養(yǎng)豐富，適應(yīng)性強，很有推廣價值。在甘肅甘南高寒草甸草原，歪頭菜對當(dāng)?shù)靥厥獾淖匀画h(huán)境有天然的適應(yīng)能力，也是動物飼料中的蛋白質(zhì)重要來源。自然生長的歪頭菜產(chǎn)量不高，生長季后期木質(zhì)化嚴重，動物適口性差，易引起牲畜消化不良，其種子在自然條件下不易萌發(fā)。因此，對歪頭菜進行改良是必要的。本研究構(gòu)建了歪頭菜植株再生體系，并通過微繁獲得大量組培苗，為歪頭菜的分子遺傳學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。同時，以組培苗為材料提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄，

2、擴增木質(zhì)素合成相關(guān)基因咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)、阿魏酸-5-羥化酶(F5H)、肉桂醇脫氫酶(CAD)片段，為歪頭菜相關(guān)基因功能研究奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下：
　　 1)歪頭菜種子經(jīng)98％濃硫酸處理25min，28℃無菌水浸泡至充分吸漲，轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)5d后，萌發(fā)率能達到最大的98％；
　　 2)叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS+IBA0.5mg/L+6-BA0.5mg/L；莖段扦插最佳培養(yǎng)基為M

3、S培養(yǎng)基；愈傷組織誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+2,4-D4.0mg/L+6-BA0.5mg/L；愈傷繼代最佳培養(yǎng)基為MS+2,4-D2.0mg/L+6-BA0.5mg/L+水解酪蛋白(300mg/L)；在MS+2,4-D1.0mg/L+6-BA0.5mg/L培養(yǎng)基上，莖段直接成苗率最高達66.7％；不同來源外植體根誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基均為1/2MS培養(yǎng)基，平均生根數(shù)最高為1.33條。
　　 3)外植體用2.0g/L可溶性聚乙烯吡咯烷酮(PV

4、P)浸泡15min，4℃低溫處理12h，然后暗培養(yǎng)5d后轉(zhuǎn)移至含4.0mg/L2,4-D、0.5mg/L6-BA、0.2g/LVc、1.0g/LPVP、0.04％DTT和0.3g/L水解酪蛋白的1/2MS培養(yǎng)基上，愈傷組織誘導(dǎo)和繼代過程中褐化時間會延后，程度會減輕?？s短轉(zhuǎn)苗周期對抗褐化也有一定的作用。
　　 4)自然生長歪頭菜幼嫩莖葉和組培苗(含凍存)莖葉都可用于總RNA提取，但第4代組培苗提取的RNA完整性和純度最佳，多代培養(yǎng)