堆肥過程中木質(zhì)素降解及甲烷排放相關(guān)功能基因研究.pdf

1、堆肥化作為一種有效處理農(nóng)業(yè)廢物的方法已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，堆肥過程中微生物與有機(jī)質(zhì)相互作用、相互影響，成為影響堆肥進(jìn)程的關(guān)鍵因素。木質(zhì)纖維素是農(nóng)業(yè)廢物中的主要難降解有機(jī)物，木質(zhì)素由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜不易水解，且對(duì)纖維素和半纖維素的天然屏障作用，使得堆肥過程中木質(zhì)纖維素難于降解。木質(zhì)素是腐殖質(zhì)形成的前體物質(zhì)，因此木質(zhì)素的生物降解成為堆肥過程的限速步驟。漆酶是木質(zhì)素降解的三大功能酶之一，在自然界和堆肥化過程中木質(zhì)素的降解中起著重要作用。傳統(tǒng)觀念認(rèn)為

2、真菌漆酶在自然界中木質(zhì)素降解起重要作用，最近研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌也能產(chǎn)漆酶，且某些細(xì)菌漆酶具有耐熱性、耐堿性等優(yōu)良特性，這些特性有助于它們?cè)诙逊蔬^程的高溫、弱堿性環(huán)境中保持活性，因此可能在堆肥木質(zhì)素的降解過程過程中發(fā)揮重要作用?；谝陨喜孪?，我們分析了農(nóng)業(yè)秸稈堆肥化過程中潛在產(chǎn)漆酶細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)變化及其對(duì)理化參數(shù)的響應(yīng)?；诳寺∥膸斓南到y(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，堆肥期間的細(xì)菌漆酶基因多樣性較為豐富，測(cè)得的序列與參考序列共形成13個(gè)進(jìn)化枝。所測(cè)得的22

3、5個(gè)有效漆酶基因序列中與γ-proteobacteria，α-proteobacteria和Bacteroidetes相似度較高的漆酶基因序列占總數(shù)的86.2％，前兩類序列存在于分析的所有樣品中，Bacteroidetes相關(guān)序列僅降溫期樣品中沒有出現(xiàn)。因此，這三個(gè)類別的序列為堆肥體系中的漆酶基因優(yōu)勢(shì)類群，其編碼氨基酸很可能參與堆肥中的酚氧化酶活的合成和木質(zhì)素的降解。鞘脂單胞菌目相關(guān)的序列為系統(tǒng)發(fā)育樹上最大的分枝，該類序列在所分析的5個(gè)

4、克隆文庫中均有出現(xiàn)，特別是在高溫期和降溫期樣品中占了非常顯著的優(yōu)勢(shì)地位。對(duì)5個(gè)堆肥樣品進(jìn)行Jackknife Cluster和UniFrac PCoA分析，結(jié)果表明堆肥4個(gè)時(shí)期的樣品的分布具有明顯的階段性。Pearson和RDA多元分析結(jié)果均表明，溫度、WSC、C/N和FA與堆肥過程中細(xì)菌漆酶基因組成結(jié)構(gòu)的變化呈正相關(guān)，pH和HA與堆肥細(xì)菌漆酶組成負(fù)相關(guān)。在所有的環(huán)境因子中，溫度對(duì)堆肥細(xì)菌漆酶基因結(jié)構(gòu)的影響最大，另外顯著性的影響因子為H

5、A。HA與堆肥腐熟期樣品的漆酶基因分布呈正相關(guān)，這與堆肥腐熟期腐殖質(zhì)的形成相對(duì)應(yīng)。
　　在上一步工作基礎(chǔ)上，本文繼續(xù)分析了細(xì)菌、真菌和鏈霉菌漆酶基因?qū)Χ逊手心举|(zhì)素降解的貢獻(xiàn)差異，在基因水平和轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)三類微生物漆酶基因的進(jìn)行了定量。結(jié)果表明，細(xì)菌和真菌漆酶基因及其轉(zhuǎn)錄水平都遠(yuǎn)高于鏈霉菌漆酶基因；細(xì)菌和鏈霉菌的漆酶基因及其表達(dá)量在堆肥過程中表現(xiàn)出相似的變化規(guī)律，高溫期具有相對(duì)較高的細(xì)菌和鏈霉菌漆酶基因及表達(dá)豐度，而真菌漆酶基因拷貝

6、數(shù)和表達(dá)量在堆肥高溫階段卻有明顯減少，表明堆體含有大量能適應(yīng)堆肥環(huán)境的產(chǎn)漆酶細(xì)菌和鏈霉菌種群，且高溫期環(huán)境能刺激其漆酶基因的表達(dá)，但是大部分產(chǎn)漆酶真菌可能無法適應(yīng)堆肥的高溫和弱堿性條件，導(dǎo)致漆酶基因豐度及其表達(dá)在高溫期有所降低。相關(guān)性分析結(jié)果表明細(xì)菌和鏈霉菌漆酶基因表達(dá)與兩個(gè)pH6.5和8.0下測(cè)得的酚氧化酶活呈顯著正相關(guān)，表明細(xì)菌和鏈霉菌是堆肥過程中酚氧化酶的合成的主要參與者。盡管細(xì)菌漆酶基因轉(zhuǎn)錄水平與酚氧化酶活呈顯著正相關(guān)關(guān)系，但是

7、與木質(zhì)素降解的正相關(guān)關(guān)系不顯著，可能是因?yàn)槎逊蔬^程中木質(zhì)素的降解是由多種酶共同作用的結(jié)果，除了漆酶，許多其它的酶可能也參與了木質(zhì)素的降解。真菌漆酶基因表達(dá)與木質(zhì)素、半纖維素和纖維素的降解速度都呈負(fù)相關(guān)，這可能是因?yàn)檎婢崦富蛟诙逊虱h(huán)境下可能僅有少部分能表達(dá)并轉(zhuǎn)化為有效的酚氧化酶活，因此無法在木質(zhì)素降解過程中發(fā)揮主要作用。鏈霉菌漆酶基因轉(zhuǎn)錄與木質(zhì)素降解速度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，表明堆肥過程中絕大部分鏈霉菌漆酶基因可能都表達(dá)并轉(zhuǎn)化成了有效的酚

8、氧化酶活，參與了木質(zhì)素的降解。
　　除了對(duì)堆肥體系中的漆酶基因進(jìn)行分子生態(tài)學(xué)研究，本文還通過分離培養(yǎng)篩選出了一株產(chǎn)漆酶菌株哈茨木霉（Hypocrea lixii sp. C2），通過RACE擴(kuò)增出了其 cDNA全長，并將其在原核細(xì)菌中進(jìn)行了表達(dá)，純化得到了漆酶蛋白，SDS-PAGE顯示條帶大小約為60 kDa。該漆酶的酶學(xué)性質(zhì)顯示，純化后漆酶對(duì)多種研究底物的最適反應(yīng) pH值為4.5，漆酶在 pH<7.0的環(huán)境下相對(duì)較為穩(wěn)定，能適應(yīng)

9、較大的酸性 pH范圍，在堿性環(huán)境下酶活下降很快。新漆酶最適宜反應(yīng)溫度為35℃，在溫度在20～50℃范圍內(nèi)漆酶酶活的變化相對(duì)平緩，而在50～70℃時(shí)，漆酶酶活下降很快。溫度與漆酶穩(wěn)定性關(guān)系的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明新漆酶對(duì)中溫有一定適應(yīng)能力，但在高溫條件下較為敏感。對(duì)Hypocrea lixii sp. C2漆酶的底物特異性與動(dòng)力學(xué)進(jìn)行分析，比較 ABTS、L-DOPA和愈創(chuàng)木酚三種常見漆酶底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明新漆酶對(duì)三種底物的Km值大小順序?yàn)?/p>

10、ABTS<愈創(chuàng)木酚愈創(chuàng)木酚>L-DOPA，表明ABTS新漆酶的最適反應(yīng)底物。分析了金屬離子對(duì)漆酶活性的影響，結(jié)果表明在一定濃度的K+、Ba2+、Mg2+、Cu2+、Ca2+環(huán)境下新漆酶能保持大部分的酶活，甚至在低濃度的情況下，還能不同程度刺激漆酶的催化活性，Zn2+、Mn2+、Fe3+、Hg2+對(duì)酶有抑制作用，其中 Hg2+的抑制作用最強(qiáng)，濃度在8mM時(shí)，酶活僅為41.8%。Cu2+在三

11、個(gè)濃度下對(duì)漆酶酶活均有刺激作用，特別是當(dāng)Cu2+濃度為8 mM時(shí)，相對(duì)酶活達(dá)到了137.6%?？疾炝?種抑制劑EDTA、NaN3、TGA、DDC和乙醇對(duì)新漆酶活性的影響，結(jié)果顯示隨著抑制劑濃度的升高，抑制作用越顯著。其中EDTA、NaN3、TGA、DDC的抑制作用非常明顯，特別是當(dāng) NaN3的濃度為20μM時(shí)，新漆酶的活性完全被抑制，而乙醇對(duì)酶活的抑制作用相對(duì)較弱。復(fù)雜的環(huán)境污染物中含有不同的金屬離子和酶抑制劑，因此，研究金屬離子和抑制

12、劑對(duì)漆酶活力的影響對(duì)于漆酶在環(huán)境污染物降解中的應(yīng)用將起到重要的指導(dǎo)意義。
　　控制堆肥過程中甲烷等溫室氣體的排放是堆肥化處理過程中又一個(gè)重要方面。本論文比較了好氧堆肥和厭氧堆肥在處理畜禽糞便過程中的甲烷排放量，同時(shí)分析了堆肥過程中與甲烷排放相關(guān)的兩類微生物——產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌與甲烷排放的關(guān)系。甲烷排放分析結(jié)果表明，在50天堆置過程中好氧堆肥的CH4累計(jì)排放量明顯低于厭氧堆，約為厭氧堆的1/3，因此好氧堆肥在甲烷排放量方面是明顯

13、優(yōu)于厭氧堆的一種糞便處理方式。通過mcrA和pmoA基因分別表征產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌，分析產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌的豐度與甲烷排放之間的相關(guān)性，Pearson相關(guān)性和回歸分析結(jié)果均表明好氧堆肥堆體表面甲烷排放量與mcrA基因豐度的對(duì)數(shù)值和mcrA：pmoA的比值呈顯著線性正相關(guān)；厭氧堆堆體表面甲烷排放量與mcrA：pmoA的比值呈顯著線性正相關(guān)。這一結(jié)果佐證了我們之前的假定，即堆肥過程中甲烷的凈排放量取決于產(chǎn)甲烷的基因和甲烷氧化的基因之間的