基因傳感器檢測木質(zhì)素降解酶基因及堆肥群落多樣性研究.pdf

1、堆肥化技術(shù)在城市生活垃圾處理中已經(jīng)得到越來越廣泛地應(yīng)用。堆肥系統(tǒng)中,微生物降解木質(zhì)素的代謝過程由一系列酶共同完成,而錳過氧化物酶(MnP)和纖維二糖脫氫酶(CDH)在其中起了關(guān)鍵性作用。用DNA生物傳感器檢測其編碼基因,能更好地了解這兩種酶的協(xié)同作用。本研究擬制備固定化核酸探針傳感器用于檢測黃孢原毛平革菌錳過氧化物酶和纖維二糖脫氫酶的編碼基因,探討DNA傳感器用于同時檢測兩種堆肥高效降解菌產(chǎn)酶基因的可行性。同時運(yùn)用PCR-DGGE技術(shù)對

2、堆肥中微生物群落多樣性進(jìn)行了研究。
　　 首先研究了DNA生物傳感器單獨檢測黃孢原毛平革菌錳過氧化物酶編碼基因。利用自組裝單分子膜技術(shù),將毓基修飾的探針固定在金電極表面。采用交流阻抗法和循環(huán)伏安法,表征疏基修飾的ssDNA在金電極上的固定及雜交過程。再用計時電流法掃描,得出電化學(xué)信號與目標(biāo)鏈濃度間的線性關(guān)系。研究了目標(biāo)序列的線性檢測范圍、特異性以及各種影響因素。該傳感器的線性范圍為4×10-1～1×10-12 M,檢測限為1.0

3、×10-12M。
　　 接著,將巰基修飾的兩種木質(zhì)素降解酶-錳過氧化物酶、纖維二糖脫氫酶的寡核苷酸探針通過自組裝的方法固定在金電極表面。通過靶基因序列與其互補(bǔ)鏈之間夾心式雜交后序列的高度選擇性和極強(qiáng)的分子識別能力,將辣根過氧化物酶、漆酶分別標(biāo)記在不同的酶基因上,利用酶標(biāo)的不同催化反應(yīng)將雜交信號放大,實現(xiàn)對兩種木質(zhì)素降解酶編碼基因同時進(jìn)行電化學(xué)檢測。錳過氧化物酶、纖維二糖脫氫酶靶基因序列的濃度分別在1.0×10-11～4.0×10

4、-8M和1.0×10-10～4.0×10-8M范圍時,其濃度的對數(shù)值和兩種酶催化反應(yīng)產(chǎn)生的電流變化值呈線性相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為0.9884和0.9881,檢出限分別為1.0×1011 M和5.0×10-11 M。同一目標(biāo)鏈濃度均平行測定三次,其RSD分別為4.30％和3.52％。該傳感器特異性強(qiáng),靈敏度高,重復(fù)性和穩(wěn)定性也較好。
　　 最后,通過PCR-DGGE(變性梯度凝膠電泳)方法分析了堆肥過程中微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性及其