碭山酥梨果實(shí)木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因COMT的克隆和表達(dá)分析.pdf

1、碭山酥梨(Pyrus bretschneideri cv.Dangshan Su)原產(chǎn)安徽省碭山縣，栽培歷史悠久，是我國(guó)主要的梨出口品種。近幾年來，由于氣候變化、栽培管理粗放等原因，梨果實(shí)中石細(xì)胞含量增加，影響其食用品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。梨果實(shí)中石細(xì)胞是一種厚壁組織細(xì)胞，是次生壁在初生壁上沉積形成的，與木質(zhì)素的合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及沉積均密切相關(guān)。咖啡酸氧甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶，主要參與S-木質(zhì)素的合成。碭山酥梨果實(shí) COMT基因的

2、克隆，目前未見報(bào)道。因此，克隆和鑒定碭山酥梨果實(shí)中COMT基因，探討COMT的分子特性，對(duì)利用分子生物學(xué)技術(shù)調(diào)控梨木質(zhì)素的合成和石細(xì)胞的發(fā)育意義重大。
　　本研究以碭山酥梨果實(shí)為材料，克隆其 COMT cDNA全長(zhǎng)，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，進(jìn)行原核表達(dá)和實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析，另外還成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體，為后期蛋白定位和遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下：
　　1.利用RT-PCR技術(shù)并結(jié)合 RACE方法得到碭山酥梨咖啡酸氧甲基

3、轉(zhuǎn)移酶(COMT)基因的全長(zhǎng)cDNA，命名為PbCOMT，GenBank登錄號(hào)為KC905086。PbCOMT基因全長(zhǎng)1371 bp，其開放閱讀框?yàn)?098 bp，編碼365個(gè)氨基酸。
　　2.生物信息學(xué)分析結(jié)果為：PbCOMT蛋白的理論分子量約為40 KD，理論等電點(diǎn)為5.61。PbCOMT氨基酸序列與蘋果的COMT氨基酸同源性最高，相似性達(dá)94％。PbCOMT蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有34.25%α螺旋，16.44%伸展鏈，49.32

4、%的無規(guī)則卷曲。 PbCOMT蛋白為疏水性蛋白，其N端無信號(hào)肽，說明該蛋白可能定位在細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，屬于非分泌性蛋白。PbCOMT蛋白的N末端有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)二聚作用的結(jié)構(gòu)域，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了催化SAM的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域。
　　3.將該基因重組到表達(dá)載體 pET-32a(+)中進(jìn)行原核表達(dá)，經(jīng) IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE檢測(cè)表明，PbCOMT基因能在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)，電泳檢測(cè)到一條大約60 KD的外源蛋白，與預(yù)測(cè)的融合蛋

5、白分子量相符。
　　4.實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育時(shí)期(23 d，39 d，47 d，63 d和125 d)碭山酥梨果實(shí)PbCOMT基因表達(dá)量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在63 d時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量?；ê?7 dPbCOMT基因表達(dá)量，果中部＞近果核＞近果皮，并且果中部明顯高于近果皮和近果核；而63 d PbCOMT基因表達(dá)量，近果核＞近果皮＞果中部。
　　5.以pCAMBIA1301-EGFP為真核載體質(zhì)粒，成功構(gòu)建了1