絨毛白蠟表達譜分析及MYB基因的克隆和功能研究.pdf

1、林業(yè)在國民經(jīng)濟發(fā)展、維護生態(tài)平衡、提供高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)林木方面具有重要作用,而高鹽等非生物脅迫因素則嚴(yán)重制約著林木的生長發(fā)育及產(chǎn)量。植物耐鹽性狀通常受多個基因的調(diào)控,其應(yīng)答基因涉及植物生理代謝、離子運輸以及物質(zhì)合成等各個方面。闡明植物的耐鹽調(diào)控分子機制,對于通過基因工程手段來增強樹種耐鹽性具有重要的理論指導(dǎo)意義。絨毛白蠟是我國重要的林木種質(zhì)資源之一,以較強的耐鹽、耐旱等特性著稱,是優(yōu)良的鹽堿地造林綠化和城市園林綠化樹種。目前對于鹽脅迫下模式植物

2、的轉(zhuǎn)錄組變化等分子生物信息研究相對深入,而對木本植物這方面的研究相對較少。
　　本研究以耐鹽樹種絨毛白蠟為材料,通過高通量測序?qū)Σ煌瑫r間段鹽脅迫下的絨毛白蠟幼苗進行表達譜分析,從中獲得了大量與鹽誘導(dǎo)相關(guān)的基因,通過qRT-PCR驗證了8個基因在鹽脅迫下的表達模式;并在此基礎(chǔ)上,克隆了2個MYB轉(zhuǎn)錄因子基因及其啟動子序列進行功能研究。結(jié)果將為深入了解絨毛白蠟?zāi)望}分子機制以及絨毛白蠟樹種遺傳改良奠定理論基礎(chǔ)。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:<

3、br>　　1.絨毛白蠟鹽脅迫下的表達譜分析
　　(1)以高鹽脅迫下的絨毛白蠟幼苗為材料,采用數(shù)字基因表達譜技術(shù)對本實驗中的6份樣品進行序列測定,總共進行了55,525,943次讀數(shù)。經(jīng)測序分析,在三組比較中分別得到差異表達的基因數(shù)為72、1345、1379個。其中有4個差異表達基因為3個差異文庫所共有,每個差異文庫特異性表達的基因數(shù)目分別為50、317和353個。
　　(2)GO顯著性富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn):NaCl脅迫0.5 h

4、后顯著上調(diào)的GOterms主要集中于氧化脅迫響應(yīng)、逆境脅迫響應(yīng)、硝酸鹽反應(yīng)、端粒酶活性調(diào)節(jié)以及端粒酶正向調(diào)控方面。NaCl脅迫24 h后,顯著上調(diào)的GO terms數(shù)量明顯增多,除包括上述功能外,還包括脫水干旱響應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、非生物脅迫刺激響應(yīng)、ABA信號通路的調(diào)控等。Pathway顯著性富集分析共篩選出20條可能與鹽脅迫有關(guān)的代謝途徑,如植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、淀粉和蔗糖代謝途徑、植物病原體互作途徑、苯丙素生物合成途徑、細胞凋亡途徑、類

5、胡蘿卜素生物合成途徑以及戊糖和葡萄糖醛酸酯轉(zhuǎn)換途徑等。
　　(3)通過分析和比較NaCl脅迫不同時間點絨毛白蠟的基因表達譜,篩選得到許多鹽脅迫響應(yīng)基因。這些基因的功能主要涉及滲透調(diào)節(jié)與離子平衡、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、活性氧清除、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面。推測這些基因很可能參與了絨毛白蠟的耐鹽脅迫過程。
　　(4)為驗證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性,選擇了8個差異表達基因,利用實時定量qRT-PCR方法驗證了上述基因在NaCl脅迫下的基因表達模式,發(fā)現(xiàn)在N

6、aCl脅迫0.5 h和24h后這些基因表達趨勢與表達譜測序結(jié)果一致。
　　2.絨毛白蠟MYB轉(zhuǎn)錄因子基因的克隆及表達分析
　　(1)通過RACE手段結(jié)合表達譜測序結(jié)果,首次克隆到2個絨毛白蠟MYB基因的cDNA全長,命名為FvMYB1和FvMYB2。其中,FvMYB1基因cDNA全長為1203 bp,編碼301個氨基酸,分子量約為33.38 kDa,基因組擴增表明該基因無內(nèi)含子;FvMYB2基因cDNA全長為1201 bp,

7、編碼311個氨基酸,分子量約為35.00 kDa,基因組序列全長為1476 bp,含有3個外顯子和2個內(nèi)含子。
　　(2)基因組織表達模式分析結(jié)果表明:兩者在被檢測組織中均有表達,其中 FvMYB1基因在莖中表達量最高,在根中表達量最低;FvMYB2基因的表達量在各組織中差異不大。對不同非生物脅迫下的基因表達模式研究表明:在NaCl、PEG和ABA處理下,FvMYB1和FvMYB2基因表達模式存在異同。其中2個基因的表達量最高值分

8、別在各處理12 h和6 h時出現(xiàn),但FvMYB1基因只對NaCl和PEG響應(yīng),而FvMYB2基因可響應(yīng)上述三種脅迫。暗示后者可能在植物應(yīng)對非生物脅迫過程中發(fā)揮著更重要的作用。
　　(3)亞細胞定位結(jié)果表明,FvMYB1和FvMYB2基因編碼的蛋白均主要定位于細胞核中。酵母轉(zhuǎn)錄激活實驗表明,兩者均有轉(zhuǎn)錄激活活性,能夠激活下游報告基因的表達,其中FvMYB2半乳糖苷酶活性高于FvMYB1。
　　(4)構(gòu)建了HIS-FvMYB1和

9、HIS-FvMYB2融合蛋白表達載體并在大腸桿菌BL21中誘導(dǎo)表達,通過SDS-PAGE以及Western雜交分別驗證了2個融合蛋白的表達。從而為后續(xù)進行轉(zhuǎn)基因植物中目的蛋白的Western雜交提供相應(yīng)的抗體制備蛋白基礎(chǔ)。
　　(5)構(gòu)建了CaMV35S啟動子驅(qū)動的FvMYB1、FvMYB2基因的植物過表達載體,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草,對Kan篩選獲得的轉(zhuǎn)基因植株進行PCR和Southern雜交檢測。并對正常生長條件下轉(zhuǎn)基因植株

10、中脅迫相關(guān)基因的表達進行了分析,結(jié)果表明NtP5CS、NtLEA5、NtMnSOD的表達量均高于對照。進一步對轉(zhuǎn)基因植株進行鹽脅迫處理后的表型及生理生化分析,結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因煙草的鹽害癥狀輕于野生型煙草;且鹽脅迫條件下,轉(zhuǎn)基因植株在SOD、POD、CAT保護酶活性、脯氨酸含量方面均不同程度的高于野生型, MDA含量低于對照;而葉綠素含量僅 FvMYB2轉(zhuǎn)基因煙草高于對照。實驗結(jié)果表明FvMYB1和FvMYB2基因具有增強植物耐鹽性的功能

11、。
　　3.絨毛白蠟FvMYB1和FvMYB2啟動子克隆及分析
　　(1)為進一步鑒定該基因的功能,對FvMYB1和FvMYB2基因的啟動子進行克隆及其表達研究。利用染色體步移法(Walking)從絨毛白蠟基因組中克隆到這兩個基因起始密碼子上游各自l140bp和1600 bp的啟動子序列。通過PlantCARE分析FvMYB1和FvMYB2啟動子中含有的順式作用元件,表明兩者除具有 TATA-box、CAAT-box等典型的

12、真核生物順式調(diào)控元件外,還含有大量的光反應(yīng)相關(guān)元件:G-box、GATA-motif、I-box、Box4、GAG-motif、C-box等;脅迫響應(yīng)元件:鹽誘導(dǎo)元件GT1GMSCAM4、ABA響應(yīng)元件ABRE、MBS干旱誘導(dǎo)元件、水楊酸反應(yīng)元件TCA、熱誘導(dǎo)元件HSE、低溫響應(yīng)元件LTR等。
　　(2)為進一步研究各順式元件的作用,將 FvMYB1和 FvMYB2啟動子序列的不同5’端缺失片段替換植物表達載體pCAMBIA330

13、1的35S啟動子,構(gòu)建了以GUS為報告基因的缺失表達載體,并通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化獲得包含不同目的片段的轉(zhuǎn)基因煙草。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明:FvMYB1基因3個缺失片段長度的啟動子(242 bp、523 bp和792 bp)具有啟動功能;FvMYB2基因中858 bp和1600 bp長度的啟動子可使轉(zhuǎn)基因煙草GUS染色呈藍色。且其中4個啟動子缺失片段在鹽脅迫后 GUS染色加深,表明 FvMYB1和FvMYB2啟動子均在一定程度上受鹽脅迫誘導(dǎo)