花生耐鹽基因的克隆與表達(dá)譜分析.pdf

1、花生(Arachis hypogaea)是我國(guó)重要的油料經(jīng)濟(jì)作物，但隨著全球水資源危機(jī)以及土壤鹽漬化的加劇，鹽脅迫已經(jīng)成為影響花生生長(zhǎng)并導(dǎo)致減產(chǎn)的主要因素。因此尋找花生耐鹽的關(guān)鍵因子、了解其耐鹽機(jī)制和改良花生耐鹽性狀成為勢(shì)在必行的任務(wù)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多耐鹽基因被相繼克隆。本文成功的克隆出了花生中的兩種耐鹽基因液泡膜Na+/H+逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHX1基因和多胺生物合成中的一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)酶SAMDC基因，并對(duì)兩個(gè)基因的結(jié)構(gòu)功能進(jìn)行

2、了生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，進(jìn)而通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)分析了不同鹽脅迫下兩個(gè)基因在花生各組織器官的表達(dá)特征，具體研究結(jié)果如下:
　　1.根據(jù)己知的液泡膜Na+/H+逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物，利用RT-PCR，3'、5'RACE技術(shù)，從花生cDNA中克隆到液泡膜Na+/H+逆轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NHX1基因，命名為AhNHX1。該cDNA全長(zhǎng)2331bp，包括1620bp的開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)，450bp

3、的5'端非翻譯區(qū)(5'Untranslated Regions，5'UTR)和261bp的3'端非翻譯區(qū)(3'Untranslated Regions，3'UTR)，3'UTR含有一個(gè)22bp的poly(A)尾巴；該cDNA編碼539個(gè)氨基酸，推測(cè)分子量為59.3Kda，等電點(diǎn)為6.20，其氨基酸序列與大豆GmNHX1、檸條CkNHX1、三葉草Tr NHX1、山羊豆GoNHX1、百脈根LtNHX1、紫花苜蓿MsNHX1和刺槐RpNHX1

4、的同源性分別為84.07％、83.73％、82.99％、82.92％、82.69％、82.53％、和81.89％；AhNHX1基因編碼的蛋白含有12個(gè)跨膜區(qū)，N端具有高度保守的氨氯吡嗪咪結(jié)合位點(diǎn):84LFFIYLLPPI93，此外，AhNHX1含有2個(gè)糖基化位點(diǎn)，分別為Asn50、Asn293，是已糖基化的蛋白，AhNHX1已在GenBank注冊(cè)，登錄號(hào):HM590627。
　　2.根據(jù)己知的SAMDC基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，利

5、用RT-PCR，3'、5'RACE技術(shù)，從花生cDNA中克隆到 SAMDC基因，命名為AhSAMDC。該cDNA全長(zhǎng)1984bp，包括1077bp的開(kāi)放閱讀框(ORF)，741個(gè)堿基的5'端非翻譯區(qū)(5'UTR)和166bp的3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)，其中5'URT有兩個(gè)uORF(upstream ORF)，3'URT含有一個(gè)12bp的poly(A)尾巴和一個(gè)可能的poly(A)加尾信號(hào):AATAAA;該cDNA編碼358個(gè)氨基酸，

6、推測(cè)分子量為39.1Kda，等電點(diǎn)為4.99，其氨基酸序列與鷹嘴豆、扁白豆、豌豆、大豆和紫苜蓿的SAMDC氨基酸序列同源性分別為84.92％、77.72％、81.01％、81.84％和83.52％，具有SAM-decarbox結(jié)構(gòu)域以及該基因家族的酶原剪切位點(diǎn):70LSESSLF76和與SAMDC蛋白快速降解相關(guān)的PEST結(jié)構(gòu)域:248TIHVTPEDGFSYASFE263.此序列已在GenBank注冊(cè)，登錄號(hào):HM070023.

7、>　　3.本研究以18S rRNA作為內(nèi)參基因，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了不同鹽濃度處理下AhNHX1基因和AhSAMDC基因在花生根莖葉中的表達(dá)情況。結(jié)果表明:對(duì)照組和處理組花生樣本中，AhNHX1和AhSAMDC基因在各組織都有表達(dá)，屬于組成型表達(dá)；兩基因的表達(dá)都具有組織特異性和時(shí)間差異性，在不同濃度NaCl處理下，AhNHX1和AhSAMDC基因在莖和葉中的表達(dá)豐度均隨NaCl濃度的增加而減小，而在根中的表達(dá)豐度，低鹽濃度(