利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行耐鹽基因轉(zhuǎn)化花生的研究.pdf

1、土壤鹽漬化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的嚴(yán)重問題。據(jù)聯(lián)合國環(huán)境組織報(bào)道全球約有50％的耕地受到鹽脅迫危害。我國也有大面積的鹽堿地,僅海岸帶、灘涂地就達(dá)一億多畝,并且有逐年增加的趨勢(shì)。面對(duì)人口不斷增加、耕地日趨減少和淡水資源嚴(yán)重不足的現(xiàn)實(shí),如何利用大面積的鹽堿地和豐富的海水資源,這是人類迫切需要解決的重大課題。隨著生物技術(shù)的發(fā)展,人們寄希望于基因工程育種,即通過直接導(dǎo)入耐鹽基因,使轉(zhuǎn)基因作物獲得耐鹽性,實(shí)現(xiàn)在鹽堿地或海灘上用海水澆灌種植農(nóng)作物

2、的夢(mèng)想。
　　本論文研究選用已在模式植物中證實(shí)能增強(qiáng)耐鹽性的mtlD(mannitol-1-phosphate dehydrogenase)基因及生長(zhǎng)在海灘上的具有耐鹽堿等特性的鹽生植物-秋茄(Kandelia candel L.Druce)和海邊月見草(Oenothera littaralis Schlect)的總DNA作為目的基因,通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)法和花粉管通道法轉(zhuǎn)化優(yōu)良栽培花生品種(Arachis hypogaea L.c

3、v. Shanyou523),以期獲得轉(zhuǎn)基因耐鹽花生。本研究是國內(nèi)外首次進(jìn)行單個(gè)耐鹽基因和鹽生植物總DNA轉(zhuǎn)化花生的研究。主要結(jié)果如下:
　　1.建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)mtLD基因?qū)牖ㄉ倪z傳轉(zhuǎn)化體系。整個(gè)遺傳轉(zhuǎn)化過程主要分為預(yù)培養(yǎng)、共培養(yǎng)、誘芽、促芽、生根及移栽六個(gè)步驟。取萌發(fā)7-8d的花生葉片,切取中段為外植體,在誘芽培養(yǎng)基(MS+0.8mg/LNAA+3mg/L6-BA+2mg/L AgNO3+6mg/L GLutamine

4、+30g/L Sucrose+0.7%Agar,pH5.8)上預(yù)培養(yǎng)3d,然后在農(nóng)桿菌菌液中浸泡5min,放在誘芽培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2 d,再用含有500mg/L羧芐青霉素的無菌蒸餾水沖洗后,置于添加了500mg/L羧芐青霉素和80mg/L新霉素的誘芽培養(yǎng)基上進(jìn)行選擇培養(yǎng),直到長(zhǎng)出幼芽(大約5w)。轉(zhuǎn)入添加了500mg/L羧芐青霉素和80mg/L新霉素的促芽培養(yǎng)基(MS+3mg/L6-BA+2mg/LAgNO3+30g/LSucrose+0

5、.7% Agar, pH5.8)中培養(yǎng),3w后將長(zhǎng)出的小苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(MS+0.8mg/L NAA+2mg/L AgNO3+30g/L Sucrose+0.7% Agar, pH5.8),大約2w后將長(zhǎng)出強(qiáng)壯根系的植株移栽到沙土中。
　　2.通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)mtlD基因轉(zhuǎn)化花生共獲得57個(gè)再生植株。提取這些植株的葉片DNA進(jìn)行PCR反應(yīng),然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Southern雜交分析。結(jié)果有3株轉(zhuǎn)化植株在PCR反應(yīng)中能產(chǎn)生1

6、.1kb大小的預(yù)期DNA片段,而且該片段可與mtlD基因探針進(jìn)行特異性雜交,而陰性對(duì)照植株沒有此預(yù)期DNA片段產(chǎn)生,表明mtlD基因已整合進(jìn)花生基因組中。本次實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)化率為5.3%。
　　3.花粉管通道介導(dǎo)mtlD基因轉(zhuǎn)化花生的研究。在2001年秋季獲得“汕油523”T0代轉(zhuǎn)化植株共29株,PCR檢測(cè)到2株陽性植株,均為100μg/ml的DNA處理濃度和花萼管注射法處理,轉(zhuǎn)化率為5.9%。由這2株陽性植株共繁殖了22株T1代植株,

7、提取它們的葉片DNA分別進(jìn)行PCR反應(yīng),并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行Southern雜交分析的結(jié)果,其中一株的后代(共9株)PCR產(chǎn)物都沒有產(chǎn)生預(yù)期大小的DNA片段,而另一株的后代(共13株)中有4株在PCR反應(yīng)中能產(chǎn)生1.1kb大小的預(yù)期DNA片段,而且該片段可與mtlD基因探針進(jìn)行特異性雜交。進(jìn)一步對(duì)這4株花生的后代(T2代,共21株)進(jìn)行PCR檢測(cè),其中有7株呈陽性。這表明經(jīng)花粉管通道介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的mtlD基因已整合進(jìn)花生基因組中,并已初步獲得