提高番茄耐鹽及抗旱性的轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究.pdf

1、本研究采用的耐鹽抗旱基因Force是從擬南芥中分離出的一種攜帶轉(zhuǎn)錄輔因子的衄：hookDNA突變體，通過將此基因重組連接表選載體pBINl9，再利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的番茄葉盤轉(zhuǎn)化法來獲取番茄轉(zhuǎn)基因植株，在對(duì)番茄Money maker品種進(jìn)行耐鹽抗旱基因Force的遺傳轉(zhuǎn)化中，得到的主要研究結(jié)果如下：
　　 1、將基因Force成功重組連接于表達(dá)載體pBIN19。然后通過電擊轉(zhuǎn)化法，將所重組構(gòu)建的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌LAB4404菌株中

2、，得到含有。Force基因的工程農(nóng)桿菌；提取所得質(zhì)粒DNA,通過PCR，且XbaL,Smal雙酶切質(zhì)粒DNA，雙重驗(yàn)證鑒定結(jié)果表明Force基因已插入到pBIN19載體中，表明已經(jīng)成功構(gòu)建了實(shí)驗(yàn)必需的含有目的基因Force的表達(dá)載體，同時(shí)也成功構(gòu)建含有目的基因Force的工程農(nóng)桿菌。
　　 2、實(shí)驗(yàn)借鑒前人研究經(jīng)驗(yàn)，成功優(yōu)化構(gòu)建了高效的番茄轉(zhuǎn)化再生體系。此體系的重要性得到了極大的體現(xiàn)，從質(zhì)粒載體成功構(gòu)建，到獲得轉(zhuǎn)基因To代植株，

3、必須通過番茄的高效再生遺傳轉(zhuǎn)化體系，否則一切都不能實(shí)現(xiàn)。通過對(duì)生長激素Trans-zeatin的使用，大大增加了出愈率和出芽率，使用抗生索Tim對(duì)所得轉(zhuǎn)基因苗進(jìn)行連續(xù)地篩選，同時(shí)確定潮霉素Hyg對(duì)于番茄Money maker 品種的適宜選擇壓為5mg/L。且在生根階段使用激素IBA促進(jìn)轉(zhuǎn)基因苗的生根，大大提高了陽性轉(zhuǎn)基因苗的數(shù)目；從而減少了實(shí)驗(yàn)后期的鑒定和栽培管理的工作量。
　　 3、得到了含有耐鹽抗旱Fomc基因的16株TO代

4、轉(zhuǎn)基因苗，且收獲了T1代種子，為下一步獲得優(yōu)良、穩(wěn)定的耐鹽抗旱遺傳特性的品種打下了基礎(chǔ)。
　　 轉(zhuǎn)基因植株的基因型上，PcR鑒定證實(shí)Fome~基因在番茄基因組中得到了整合，且對(duì)植株進(jìn)行RT-PCR分析，檢測結(jié)果表明導(dǎo)入的Fome基因能在番茄T0代中有不同程度的表達(dá)。最后通過Southern印跡雜交檢測發(fā)現(xiàn)基因組DNA經(jīng)Smal單酶切后，外源DNA在番茄基因組中有不同的插入位點(diǎn)，確證目的基因Force插入并整合到番茄基因組上。