植物耐鹽轉(zhuǎn)基因研究.pdf

1、本文參考前人在林木組織培養(yǎng)工作成果和美國(guó)楓香組織培養(yǎng)體系，對(duì)影響中國(guó)楓香培養(yǎng)體系的各種因子進(jìn)行系統(tǒng)分析，建立了中國(guó)楓香愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)、不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)以及生根誘導(dǎo)和移栽的技術(shù)體系，為中國(guó)楓香分子育種奠定基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)1/2MS基本培養(yǎng)基是比較適合于中國(guó)楓香的基本培養(yǎng)基，經(jīng)過(guò)優(yōu)化的組織培養(yǎng)參數(shù)為：以下胚軸為愈傷組織誘導(dǎo)的外植體；以添加3.0mg.L-16-BA和0.5mg.L-1NAA的1/2MS基本培養(yǎng)基為愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基；添加6-B

2、A1.0mg.L-1和NAA0.1mg.L-1的1/2MS基本培養(yǎng)基為不定芽分化培養(yǎng)基。中國(guó)楓香生根比較容易，在WPM基本培養(yǎng)基中添加2.0mg.L-1的IBA，培養(yǎng)兩周后即可生根，中國(guó)楓香移栽也比較容易，但移栽后水肥管理要求相對(duì)嚴(yán)格，移栽成活率可達(dá)95％以上。 中國(guó)楓香對(duì)卡那霉素比較敏感，培養(yǎng)基中添加25mg.L-1的卡那霉素培養(yǎng)2w后外植體全部死亡。5×濃度的農(nóng)桿菌比較適宜于中國(guó)楓香轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化效率相對(duì)較高，且共培養(yǎng)期間和選擇

3、培養(yǎng)期間農(nóng)桿菌生長(zhǎng)可以得到有效抑制。 為了避免組成型啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)發(fā)育的影響以及對(duì)轉(zhuǎn)基因植株光合產(chǎn)物的浪費(fèi)，根據(jù)GENBANK上公布的序列，我們?cè)O(shè)計(jì)引物從擬南芥(Colombia生態(tài)型)中克隆了控制植物對(duì)干旱、低溫和鹽堿脅迫反應(yīng)的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子Rd29A基因，該基因全長(zhǎng)891bp，含有2個(gè)DRE反式作用元件。利用該啟動(dòng)子以及中國(guó)水稻研究所水稻生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的pBin438質(zhì)粒，構(gòu)建了由該啟動(dòng)子引導(dǎo)的含有Ω翻譯增強(qiáng)

4、子和MCS葉綠體小亞基轉(zhuǎn)運(yùn)肽(由臺(tái)灣中央研究員植物研究所胡秀敏博士贈(zèng)送)的新型質(zhì)粒pBinRd29A，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得了轉(zhuǎn)基因中國(guó)楓香陽(yáng)性植株17株，耐鹽轉(zhuǎn)基因煙草陽(yáng)性植株28株，其中轉(zhuǎn)基因煙草能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育，開(kāi)花，已經(jīng)獲得了轉(zhuǎn)基因植株的T1代種子。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株中外源基因檢測(cè)結(jié)果表明，外源基因已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株基因組中。對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草T1代種子進(jìn)行卡那霉素抗性檢測(cè)，外源基因的遺傳符合3：1分離比假設(shè)，說(shuō)明了轉(zhuǎn)基因植株