紅樹(shù)植物耐鹽基因的克隆與分析.pdf

1、植物受鹽堿和水分脅迫時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中積累大量有機(jī)滲透調(diào)節(jié)劑，如甘露醇、海藻糖、甜菜堿和脯氨酸等，而將細(xì)胞質(zhì)中的無(wú)機(jī)滲透調(diào)節(jié)劑(主要是K+)擠向液泡，使胞質(zhì)與細(xì)胞(液泡)外環(huán)境維持滲透平衡，這樣就避免了細(xì)胞質(zhì)高濃度無(wú)機(jī)離子對(duì)酶和代謝的毒害。除維持細(xì)胞的正常膨壓外，甜菜堿還具有無(wú)毒滲透保護(hù)劑的作用，能夠穩(wěn)定復(fù)雜蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)，從而使得許多代謝過(guò)程中的重要酶類在滲透脅迫下繼續(xù)保持活性。 甜菜堿是以膽堿為底物經(jīng)兩步酶催化氧化生成，催化第二步

2、反應(yīng)的是甜菜堿醛脫氫酶(betaine aldehyde dehydrogenase，BADH)。甜菜堿脫氫酶是一個(gè)限速酶，甜菜堿的增加與它的活性有關(guān)，因此BADH基因的有效表達(dá)可增強(qiáng)植物的耐鹽性。自1981年從高等植物中首次分離得到BADH基因后，對(duì)BADH基因的研究報(bào)告陸續(xù)有報(bào)道。目前，已經(jīng)先后從大腸桿菌、酵母以及多種高等植物中克隆到BADH基因的cDNA。據(jù)推測(cè)，單子葉植物的BADH基因可能位于微體中，而雙子葉植物BADH基因位于

3、葉綠體中。 本文對(duì)紅樹(shù)植物BADH基因的克隆與分析進(jìn)行了初步的探索，主要結(jié)果如下： 1、采用CTAB法提取白骨壤總RNA，經(jīng)1.0％瓊脂糖凝膠電泳和OD260與OD280的檢測(cè)，結(jié)果顯示，28S rRNA條帶亮度是18S rRNA條帶亮度2倍以上，而且OD260/OD280值非常接近2.0，表明我們提取的白骨壤總RNA完整性較好，基本上沒(méi)有發(fā)生降解；純度較高，所含雜質(zhì)很少，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中RT—PCR的進(jìn)行。 2

4、、以提取的白骨壤總RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄生成cDNA，利用簡(jiǎn)并引物，通過(guò)遞減PCR(Touch down PCR)技術(shù)擴(kuò)增出約250bp的BADH基因核心片段。經(jīng)過(guò)比對(duì)，它和已報(bào)道的白骨壤BADH基因同源性高達(dá)80％。 3、根據(jù)擴(kuò)增得到的白骨壤BADH基因片段設(shè)計(jì)引物，分別進(jìn)行3’RACE和5’RACE，擴(kuò)增白骨壤BADH基因未知的3’端和5’端，并分別得到約350bp(3'RACE)和1.0kb(5’RACE)的特異性

5、片段。測(cè)序和比對(duì)后，證實(shí)我們成功地?cái)U(kuò)增到了白骨壤BADH基因的3’端和5’端。 4、在以上實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，重新設(shè)計(jì)白骨壤BADH基因特異性引物，從白骨壤總RNA反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA中擴(kuò)增得到一條約1.5kb的特異性條帶。經(jīng)過(guò)測(cè)序和比對(duì)后，進(jìn)一步確定成功克隆到白骨壤的BADH基因。BADH基因編碼區(qū)全長(zhǎng)1509bp，編碼502個(gè)氨基酸。對(duì)BADH基因的分析發(fā)現(xiàn)，它與已報(bào)道的白骨壤BADH基因的同源性均在90％以上。 5、用T4