耐鹽野生大豆DREB類轉錄因子基因的克隆與分析.pdf

1、低溫、干旱、鹽堿等逆境條件嚴重影響作物的產量和質量，是全球農業(yè)生產亟待解決的重大問題。通過基因工程手段改良植物的抗逆性是提高作物產量的有效途徑之一。而如何利用抗逆基因資源，從大量的滲透脅迫響應基因中尋找到能夠綜合性提高作物抗逆性的基因，是植物滲透脅迫基因工程的重要前提。轉錄因子在植物逆境信號傳遞過程中發(fā)揮著關鍵作用，一個轉錄因子可以同時調控多個下游基因的表達，從而提高植物的抗逆性。 耐鹽野生大豆具有豐富的抗逆基因資源，是基因克隆

2、的理想材料。本研究以耐鹽野生大豆為試材，通過電子克隆、同源克隆、酵母單雜交方法克隆DREB(Dehydration。ResponsiveElement-Bindingprotein)類轉錄因子基因；利用生物信息學手段預測基因的結構、并對獲得的全長DREB轉錄因子基因做進化分析；應用同酵母單雜交系統(tǒng)對獲得的DREB類轉錄因子基因進行體內結合特異性分析，同時比較其與DRE順式作用元件結合能力的強弱。為野生大豆中DREB類轉錄因子基因的功能研

3、究及其在植物抗?jié)B透脅迫基因工程中的應用奠定基礎。主要研究內容如下： 1.電子克隆方法克隆GsDREB1基因應用電子克隆技術在耐鹽野生大豆中克隆了1個DREB類轉錄因子基因，與GmDREB1基因序列相似性達到99.71％，命名為GsDREB1。經SMART和InterProScan預測表明，GsDREB1基因含有AP2結構域。 2.同源克隆方法克隆DREB類轉錄因子基因應用同源克隆方法在耐鹽野生大豆中克隆了5個DREB類轉

4、錄因子基因，分別命名為GsDREBa、GsDREBb，GsDREBc，GsDREB2、GsDREB3。分別將各條基因進行序列比對，比對結果為：GsDREBc與GmDREBc的相似性為99.33％；GsDREBb與GmDREBb的相似性為97.44％；GsDREBa與GmDREBa與的相似性為93.08％；GsDREB2與GmDREB2的相似性為95.60％：GsDREB3與GmDREB3的相似性為100.00％。SMART和InterP

5、roScan預測結果表明這5個基因都含有AP2結構域。 3.酵母單雜交方法克隆與DRE順式作用元件結合的轉錄因子基因將耐鹽野生大豆幼苗進行脅迫處理，構建cDNA融合文庫。以DRE元件為“誘餌”，應用酵母單雜交方法克隆DREB類轉錄因子。從A52號克隆中得到了一條232bp的片段，這個片段不含有起始密碼子和終止密碼子，經SMART預測此片段含有AP2結構域。5’RACE延伸出了198bp，但這198bp在三種讀碼方式下都含有終止密

6、碼子。 4.DREB類轉錄因子基因體內結合特異性分析經SMART預測，獲得6個DREB基因的AP2結構域序列。應用Clastalx1.83軟件將6個基因的結構域進行比對，結果表明6個基因結構域序列都具有典型的AP2結構域特征。PCR擴增6個基因保守結構域，并在保守結構域和A52克隆兩端引入同源重組位點。應用酵母單雜交系統(tǒng)分析6個基因結構域的體內結合特異性，同時將轉化混合物涂布在含有不同濃度3-AT的三缺SD培養(yǎng)基上，比較它們與D

7、RE順式作用元件結合能力的強弱。結果表明GsDREBa，GsDREBb，GsDREBc、GsDREB1，GsDREB2、GsDREB3都能夠與DRE元件發(fā)生特異性結合，且與DRE順式作用元件結合能力相當。但A52克隆的結合力較其它6個基因弱很多。 5.DREB類轉錄因子基因的進化分析應用DNAstar軟件對GsDREBa、GsDREBb、GsDREBc、GsDREB1、GsDREB2、GsDREB36個基因進行進化分析。進化樹直